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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 前处理 » 求助细胞内总胆固醇/游离胆固醇提取方法（LC-MS）用
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lidajiu

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助细胞内总胆固醇/游离胆固醇提取方法（LC-MS）用 已有1人参与

最近打算测定巨噬细胞内的胆固醇，由于细胞量较少，因此考虑用LC-APCI-MS进行测定，但是在提取胆固醇时遇到了较大的问题，请诸位高手指教。

我考察的提取方法：
1，细胞生理盐水洗两遍，1ml生理盐水中刮下，超声裂解破碎。
2-1，对于总胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的15%KOH（乙醇溶液），震荡至澄清。
2-2，对于游离胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的 8.9mM KOH（乙醇溶液），80℃水浴1h。
3，二者皆加入等体积的异丙醇：正己烷（v/v 1:4），震荡30s进行进行萃取，萃取产物800g离心5min，取上清入新管
4，使用异丙醇：正己烷（v/v 1:4）重复萃取共三次，合并上清液，真空减压干燥

存在问题：
主要问题存在于总胆固醇的提取步骤，第一次加入萃取溶剂460ul后，震荡分层共三层，上清液不足300ul，中层浑浊，最下层澄清不足100ul。
再次加入300ul萃取溶剂，震荡分层所得上清不足200ul，最下层量增加，中间层仍浑浊。
再次加入500ul萃取溶剂，只有两层，最下层澄清，以及上层整体浑浊。

另外，游离胆固醇的提取若按照上述方法，所得上清也会越来越少

想请教：
1、最上层是否是纯正己烷，胆固醇是否溶于其中？中层的浑浊是KOH的盐沉淀，还是蛋白。大量的KOH溶解在哪？
2、我的操作是否有明显问题，大家有没有成熟的方法可以分享，最好能附参考文献，感激不尽！
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1楼 2015-03-20 18:25:29
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cashfox

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lidajiu: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-03-25 16:28:48
对于总胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的15%KOH（乙醇溶液），震荡至澄清。
主要问题存在于总胆固醇的提取步骤，第一次加入萃取溶剂460ul后，震荡分层共三层，上清液不足300ul，中层浑浊，最下层澄清不足100ul。
既然澄清，怎么会有浑浊？
15%KOH（乙醇溶液）是新制的吗？用新制的
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lidajiu
永远的伪知识分子——小小小色狼
2楼2015-03-20 19:11:48
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archbishop

禁虫 (职业作家)

优秀版主
我觉得你的澄清的那层有异丙醇和乙醇。上层浑浊的是其他的。
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雲幕低垂映桂子，江月留白問柳心。
3楼2015-03-20 19:35:45
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lidajiu

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cashfox at 2015-03-20 19:11:48
对于总胆固醇，160ul裂解液中加入300ul的15%KOH（乙醇溶液），震荡至澄清。
主要问题存在于总胆固醇的提取步骤，第一次加入萃取溶剂460ul后，震荡分层共三层，上清液不足300ul，中层浑浊，最下层澄清不足100ul。
...

谢谢您。
KOH是新配的，但您一提我想起来不知道配的对不对。直接称15g的KOH在100ml乙醇里反复震荡溶解，是这样么？

我可能没表述清楚：
第一次萃取：460ul（160样品+300ul 15%KOH乙醇），震荡后分三层。最上层 澄清，不足300ul；中层，浑浊，大概有500ul；最下层澄清，不足100ul。

我感觉胆固醇应该在最上层吧，但是文献中要萃取三次，我第一次移出最上层后，第二次应该再加多少溶剂萃取呢？  第三次呢？

谢谢您！辛苦了
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4楼2015-03-20 21:07:34
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lidajiu

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by archbishop at 2015-03-20 19:35:45
我觉得你的澄清的那层有异丙醇和乙醇。上层浑浊的是其他的。

那样品应该是在最上层么？文献中要萃取三次，我第一次移出最上层后，第二次应该再加多少溶剂萃取呢？  第三次呢？

谢谢您！
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5楼2015-03-20 21:08:35
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archbishop

禁虫 (职业作家)

优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by lidajiu at 2015-03-20 21:08:35
那样品应该是在最上层么？文献中要萃取三次，我第一次移出最上层后，第二次应该再加多少溶剂萃取呢？  第三次呢？

谢谢您！...

不谢。我觉得是在上层，但是似乎效果并不好。
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雲幕低垂映桂子，江月留白問柳心。
6楼2015-03-20 21:34:37
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cashfox

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lidajiu at 2015-03-20 21:07:34
谢谢您。
KOH是新配的，但您一提我想起来不知道配的对不对。直接称15g的KOH在100ml乙醇里反复震荡溶解，是这样么？

我可能没表述清楚：
第一次萃取：460ul（160样品+300ul 15%KOH乙醇），震荡后分三层。最上层 ...

直接称15g的KOH在100ml乙醇里反复震荡溶解，你这个的浓度应该没有15%了，15%KOH如果是质量比 15g的KOH+75g水
如果是摩尔比mol/l  84g的KOH+100g水
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永远的伪知识分子——小小小色狼
7楼2015-03-25 16:15:57
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cashfox

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by cashfox at 2015-03-25 16:15:57
直接称15g的KOH在100ml乙醇里反复震荡溶解，你这个的浓度应该没有15%了，15%KOH如果是质量比 15g的KOH+75g水
如果是摩尔比mol/l  84g的KOH+100g水...

质量比 15g的KOH+85g水
不是75，按错键鸟~~~~~
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永远的伪知识分子——小小小色狼
8楼2015-03-25 16:18:20
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