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Mr_wang2006木虫 (小有名气)
Scientist
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[交流]
【请教】神经干细胞培养问题
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最近，我开始进入神经干细胞方面的研究。首先是查阅大量神经干细胞培养的方法和protocol，然后进行胚胎12~14天的胎鼠/小鼠神经干细胞培养，7~8天后进行传代，现把在实验中遇到的问题发出，向大家请教，谢谢。具体疑问如下： 1、一般胚胎神经干细胞培养原代接种密度是2*10E5/ml，但我的神经干细胞必须达6*10E5/ml，甚至更高，才能出现漂亮的神经球，不知什么原因？ 2、我的培养液是DMEM/F12+N2+肝素钠+bEGF+FGF+Glu+双抗，有人建议我尽量再加上B27,否则成球不好，我不知两者有什么区别？还有文献加LIF,有什么作用？ 3、传代时用胰酶硝化37度10 min，再用胰酶抑制剂终止，接种时发现细胞形态与原代细胞不太一样，呈现条索状，且遮光性不好，不知怎么造成？ 4、传代培养24 h发现所有培养皿“神经球”出现贴壁，更奇怪的是球四周长了很长的绒毛，但中间质地同原代神经球，不知什么原因？ 因实验需要，急需解决问题，麻烦高手赐教，我先谢@ |
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jiangy0122
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2楼2008-06-24 10:19:52
Mr_wang2006
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通过查找文献和论坛学习，我来回答以上问题，若有不同意见请指正： 1、可能与取材部位有关，我取材时范围较大，含有大量的杂细胞，于是必须用大量计数细胞来培养成球；也可能是我培养的NSC的细胞存活下降所致。 2、有人说一般神经干细胞原代培养最好用B27，传代后可改用N2（原因有待追究） 3、已经订购invotrigen公司的胰酶替代物trypLE TM express，不需进行终止反应，且对神经干细胞损伤不大，增加细胞存活。 4、传代细胞贴壁神经球已经发上分化，许多神经干细胞已经从球内迁移出而进行分化，可能与没有半量换液所致，直接用新鲜培养液培养传代。 我的理解不知对不对，请大家指正。 |
3楼2008-06-24 11:15:29