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用过肠激酶的看过来~~~ 已有3人参与
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各位虫友大家好！ 这段时间我在做原核表达，用的载体是pET32a，表达的融合蛋白需要用肠激酶来切割。网上查酶的购买来源，好多都说肠激酶切不开。到现在一直没找到信价比可靠的公司（Sigma的用不起啊）。请问虫友用的效果比较好的肠激酶是从哪里买的，能否推荐给我？ 谢谢！   |
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本帖内容被屏蔽 |
5楼2018-09-30 14:17:09
3楼2015-12-15 16:30:49
【答案】应助回帖
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1.产品简介 雅心重组牛肠激酶是一种高纯度的重组牛肠激酶轻链片段。该酶经HPLC纯化，纯度高，特异性高，不含其他蛋白酶。肠激酶可以切割含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 赖氨酸（DDDDK）。可以在较宽pH范围（4.5-9.5）和较宽温度范围内有效切割融合蛋白。肠激酶可去除位于蛋白质N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合标签。 2.产品特性 来源 重组大肠杆菌 外观 澄清、无色至淡黄色液体 活性 ≥ 5.0 U/μl 纯度（蛋白电泳） 单一主条带 电泳（分子量） 25.8 ±2.6kDa单位定义：1U定义为在25℃，12h~16h之内，将0.5mg保存于25mM Tris-HCl 8.0 缓冲液中的融合蛋白切割95%所需的酶量。 3.推荐使用方法 1）25℃酶切条件： 按照酶活性定义，酶切条件举例： 25mM Tris-HCl 8.0体系中： 融合蛋白 0.1-1mg/ml（蛋白总量50-100μg） 重组EK 0.1-0.2U 25℃过夜酶切，或完全酶切需16-24h，用SDS-PAGE 检测酶切效果。 2）4℃低温酶切条件： 4℃能对底物进行有效酶切，但需要将酶切时间延长至48-64h，或增加2-3倍酶量。 3）酶切优化和放大 优化：可以对酶切条件进行优化，例如缓冲液pH，融合蛋白浓度，EK的量，以及酶切时间，使融合蛋白能在稳定条件下被酶切，用SDS-PAGE检测酶切效果。 放大：选择优化后的反应条件，按该条件等比例放大，用SDS-PAGE检测酶切效果。 4）去除重组肠激酶的方法：使用胰蛋白酶抑制剂亲和层析（例如sigma T0637）去除重组肠激酶。 5）注意：不建议37℃条件下酶切，可能会有非特异性酶切出现。 4.常见影响肠激酶活性的因素 在＞200mM 咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影响。可参照以下推荐方法进行酶切： 1）为获得理想酶切结果，请将样品透析到25mM Tris-HCl 8.0缓冲液中，再进行酶切。 2）若不便透析，可将样品稀释，咪唑含量在100mM以下，NaCl浓度在50mM以下，甘油浓度小于5%以下进行酶切，酶的用量与蛋白的比例不变（即1U酶切500μg蛋白）。 3）如果样品溶液中含有上述成分中的一种或多种，且不便去除，此时适当增加酶量或延长酶切时间，也可达到较好酶切效果。 5.储存和运输稳定性 酶液储存稳定性：-20℃，24个月稳定；25℃，一周内，无活性损失。缓冲体系：50mM Tris-HCl，pH8.0，250mM NaCl，2mMCa2+，50%甘油。 酶液反复冻融稳定性：反复冻融5次，无活性损失。 运输稳定性：蓝冰保温运输，稳定。 6.产品优势 特异性：特定的蛋白酶，切割前面含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端位点：天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 天冬氨酸 - 赖氨酸 (DDDDK)。 纯度高：不含其他蛋白酶，无非特异性切割。 无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料。 质量稳定：批量生产，可保证稳定连续的批次生产；产品批次间无差异，质量稳定。 符合法规要求：生产设备和生产环境符合相关法规要求，生产过程完全遵循NSF ISO 9001:2008质量体系并符合GMP指导原则。 质量文件完整：按客户需求，可提供相关法规支持文件。 7.相关产品 重组羧肽酶B； 序列分析纯胰蛋白酶； 重组人胰蛋白酶； 重组抑肽酶。 |
4楼2018-03-07 15:55:14