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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】NdeⅠ 或XhoⅠ连接实验该注意什么(问题已经解决，谢谢大家的帮助@！)
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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】NdeⅠ 或XhoⅠ连接实验该注意什么(问题已经解决，谢谢大家的帮助@！)

各位老师你们好，我最近打算做NdeⅠ 和XhoⅠ两个粘末端链接，听说要用平末端的链接条件，而且比较难连，我先撑着实验还没开始先问清楚，免得出了问题再去补救。

不知道你么有没有做过的，在做链接的时候应该注意些什么东西？
1.链接体系？
我打算用这个体系
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
DNA片段* 约0.3 pmol
载体DNA** 约0.03 pmol
T4 DNA Ligase 1 ul
dH2O up to 25 ul
2.链接温度和时间？
我打算用16度 16h
3.用不用加PEG8000？
谢谢您的解答。

注：我的载体是PET-28大小是5.3kb，目的基因是1kb.
[search]NdeⅠ XhoⅠ[/search]

[ Last edited by humants on 2008-6-27 at 19:34 ]
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1楼 2008-06-12 19:26:07
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xiukuncui

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
humants(金币+4,VIP+0):谢谢你，能不能告诉我你的QQ号，以便进一步交流，谢谢...我的号是283847409。
这l两个酶我都用过，载体也是pet28，10 ul
体系中T4及buffer分别是1 ul
，然后DNA量/DNA大小：载体量/载体大小=3：1-----10：1之间。时间4度过夜就行。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2008-06-12 21:53:38
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lzhhok

至尊木虫 (职业作家)
体系中要加入buffer，
工作浓度为一倍的
我也是用16度过夜

[ Last edited by lzhhok on 2008-6-12 at 23:57 ]
赞一下 回复此楼
3楼2008-06-12 23:55:57
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zyk_527

银虫 (小有名气)
前期的酶切也很重要，楼主的保护碱基加的够吗？好像很多保护碱基的样子
赞一下 回复此楼
4楼2008-06-13 08:52:01
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biogefart

木虫 (著名写手)

平端链接 的条件

加PEG4000好像
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闹太套
5楼2008-06-13 09:42:34
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jasco

木虫 (正式写手)
16度过夜就好了
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6楼2008-06-13 10:52:29
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