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guantou木虫 (正式写手)
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[交流]
荧光实时定量PCR引物设计需要特别注意哪些?
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请教下高手们,real-time PCR引物的设计需要注意哪些跟一般PCR不同的地方? 产物长短? TM值范围? 有的说退火温度一般比TM低5度? 染料法,不做探针 知道的指点下啊 小弟非常感谢! [ Last edited by guantou on 2008-6-11 at 20:45 ] |
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4楼2008-07-08 12:00:16
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我也在做实时定量 之前找过一些资料 下面的资料可能有用 SYBR G 1.1 primer 长度18-30bp左右 GC含量30-80%(40-60% ideally) Tm在63-67℃(64℃ ideally)，Ta在58-62℃(59℃ ideally) 引物与temp无错配，尤其是3′ 避免连续相同的碱基，尤其是靠近3′的3个或者3个以上的G或者C 3′不为T(允许错配) 引物上无发卡，不形成二聚体，尤其是3′端 跨外显子设计引物，blast检验引物是否特异 1.2 amplicon 长度80-150bp GC含量30-80%(40-60% ideally) 避免二级结构，www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold 2. Taqman 2.1 probe 长度为18-30bp，20bp为最佳，如果长度超过30bp，quencher需要放在距离5′18-25bp处 GC含量30-80%，Tm比引物高8-10℃(genotyping高8℃，expression高10℃) 选择C多于G的链，尽可能得使探针靠近引物而不发生重合 探针与模板引物不发生错配 避免连续的相同碱基，尤其是C或者G 避免5′G 2.2 primer 同SYBR 2.3 amplicon 同SYBR 3. 如果老板挺富余 找ABI定探针，有现货定现货，没现货让他们设计，到手的成功率按照我做到现在100多个探针95%左右。 尽可能定带MGB接头的，可以让实验做得很美。 – |
5楼2008-07-08 16:37:26
