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7．蛋白质组及分析技术 随着大量生物体全基因组序列的获得，特别是人类基因组序列草图的完成，基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学，而蛋白质组学（proteom）正是作为功能基因组研究的重要支柱在上世纪90年代中期应运而生。蛋白质组是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域：①蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰；②蛋白水平的差异显示在疾病中的运用；③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同。虽然可以通过cDNA芯片等方法显示生物体的基因启动状况，但mRNA水平 (包括mRNA的种类和含量 )并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。 目前，蛋白质组学研究的主要技术包括：双向（二维）聚丙烯酰胺凝胶电泳（结合等电聚焦和IEJK）分离蛋白质，在固相载体上形成蛋白质-多肽图谱，用敏感的方法染色（如银染）并用图像分析电子计算机进行鉴定；将蛋白质点切下，用酶消化，进一步用氨基酸分析、质谱分析等进行鉴定；或结合蛋白质的毛细管电泳，高效液相色谱技术（HPLC）以至蛋白质芯片进行鉴定。 蛋白质芯片 (protein array)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如 (抗体与抗原 )在空间构象上能特异性的相互识别。此方法与传统的研究方法相比具有如下优点：①蛋白质芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供相当大的信息量，使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱，这是传统的蛋白研究方法无法做到的。②蛋白质组芯片的灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级。美国科学家Haab等运用绿色荧光 (green fluorescence)标记抗体微阵列，用红色荧光 (red fluorecence)标记蛋白混和物，并运用计算机识别 (R/G)的信号强弱，来进行检测，检测水平可达到 1ng/ml。③蛋白质芯片具有高度的准确性。 蛋白质组芯片可用于蛋白质组学研究中的各个领域，具体来说大致可分为三个方面：研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，筛选新的蛋白质；蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的，如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用；蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子物质的作用。例如蛋白质与DNA ，RNA分子等。蛋白质芯片的制作是决定其运用的关键因素之一，蛋白质组芯片的制作比当前流行DNA芯片制作要复杂，特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化。因此，蛋白质芯片制作存在费时、费力且成本较高等不足，限制了其在临床的应用。 8．荧光原位杂交染色体分析技术（FISH） FISH是上世纪80年代中期发展起来并直到现在仍在不断改进、完善的技术。其基本过程是：首先制成染色体标本，和与所感兴趣的目的基因（或染色体片段）互补的探针，并在探针上标记荧光色素，当探针与染色体标本上的靶序列杂交后，利用荧光显微镜观察荧光信号从而获得染色体核型的信息。此技术具有灵敏度强、背景低、快速等优点，避免了使用稳定性差、暴光时间长、易污染环境的放射性核素，成为细胞遗传学与分子生物学之间沟通的桥梁。这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断。例如，应用bcr-abl基因探针进行FISH染色体分析诊断慢性髓系白血病。 近年来FISH技术不断发展，产生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA合成（PRINS）技术等，并且发展出多色FISH和多重FISH技术广泛应用于染色体数目和结构畸变及断裂点检测，标志染色体的识别，多个不同基因的染色体定位，物理图谱的制作，基因缺失和扩增的检测等，在肿瘤细胞遗传学分析中发挥了重要作用。 9．波谱核型分析技术（Spectral karyotyping, SKY） 传统FISH技术采用的荧光显微术基于荧光色素特异性的光学滤镜进行单强度的荧光检测，因此很难同时获得多个信号用于分析。1996年，Schrock等将傅立叶光谱学、CCD成像技术和光学显微术结合起来，建立了SKY技术，可以在可见光和近红外区的所有位置同时检测样品的发射光谱，从而可利用发射光谱内所有信息进行分析。目前SKY技术可以补充染色体常规显带分析的不足，清楚地说明G显带不能解释的复杂染色体畸变，主要用于肿瘤细胞的遗传学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。 10．分子生物学相关技术的发展及作用 10.1 毛细管电泳技术（capillary electrophoresis, CE） CE是一项迅速发展的分离技术，主要用于生物大分子的分离，如DNA和被十二烷基磺酸钠 (SDS)饱和的蛋白质，是在一根内径25～100μm毛细管内进行的，毛细管中充入交联聚合物，聚合物起到了分子筛的作用，使质量电荷比相同的物质能够按照分子由小到大的顺序流出，从而实现了分离。分辨率高于高效液相色谱，进样量只需 1～50nl，在毛细管上开一检测窗口，直接进行柱上检测，灵敏度较高，而且样品前处理非常简便，适用于大量临床样品的分析。CE有多种分离模式，其中毛细管凝胶电泳已越来越广泛地用于基因诊断、基因治疗等临床分子生物学领域。 毛细管凝胶电泳与传统的板式或管式凝胶电泳相比，具有以下特点：(1 )分辨率高，因为毛细管电泳可以施加比板式电泳高 10～100倍的场强，毛细管本身已经具有抗对流作用，不必再使用具有抗对流性的凝胶：(2 )分析速度快；(3 )定量更加准确，避免了电泳染色时因时间、温度、染色剂浓度和放置时间不同而产生的误差；(4)灵敏度更高，毛细管电泳为柱上检测，如使用激光诱导荧光检测器，检测限可以提高到10-18到10 –21mol/L；(5)实现自动化操作。能够进行制备性分离是板式凝胶电泳的优点，目前毛细管电泳使用大孔径毛细管和低场强，只可以进行少量制备，这项技术更适合于临床实验室高灵敏度快速分析的要求。 应用CE对PCR产物进行分析可以克服常规琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分析速度慢、操作繁琐、定量结果误差大、自动化程度低的缺点，现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、DNA序列分析等。 10.2 液质联用技术（LC/MS/MS） 在分析仪器行业中，质谱仪（mass spectrometer, MS）是灵敏度最高，对未知化合物的结构分析及定性最准确，要求相应标准样品或对测定化合物的了解最少的定性手段。而高效液相色谱（HPLC）则是分离化合物范围最广、准确度高、对化合物破坏性小的快速分离方法，特别适用于生物提取物的分离。随着电喷雾界面核大气压化学电离界面这两个技术成熟后，HPLC和MS/MS技术才实现成功联用，LC/MS/MS才实现飞速发展，成为科研和临床分析的有力工具。 将LC/MS/MS应用于基因遗传性代谢紊乱疾病的诊断，可在2分钟内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病，如各种氨基酸代谢失常血症包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症；短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。另外，LC/MS/MS在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛。 10.3 变性高效液相色谱技术（DHPLC） 变性高效液相色谱 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)是一项在单链构象多态性 (SSCP)和变性梯度凝胶电泳 (DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。DHPLC检测变异的基本原理：将工作温度 (柱温 )升高使DNA片段开始变性，部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链 (错配的 ) DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。这一技术最先由Oefner于 1 995年建立，目前全球使用最多也最易操作的是美国transgenomic公司开发的WAVE 核苷酸片段分析系统，它通过一个独特的DNA色谱柱—DNA Sep柱进行核酸片段的分离和分析。 方法学比较研究表明，DHPLC敏感性和特异性可达 96%～100 %，明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术。目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F-SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美。但PCR引物的设计、PCR方法及条件、分离温度及分离梯度等关键因素也影响DHPLC检测敏感性。目前，该技术在基因突变检测、DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、基因作图、细菌鉴定、DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中应用广泛，最近已被进一步应用到mRNA的检测，鉴定差异表达的基因。 10.3 非荧光标记的遗传标记分析技术 近年来，美国GENTEON公司采用激光致导的动态荧光检测技术（Dynamic fluorescence），结合多通道毛细管电泳技术，研制出Capella 400型全自动基因分析系统。该仪器采用动态荧光检测技术，彻底消除了传统荧光DNA标记检测的高成本和复杂性，可精确有效到检测未经标记的单链或双链核苷酸。Capella 400系统是全球迄今为止首创的第一台全自动384道毛细管电泳仪，该系统采用专利化学品与一个具有精密光学结构的旋转圆柱状毛细管阵列相组合，同一系统可进行多种核酸的高通量分析，可应用于SNP、STR、RFLP/AFLP分析，寡聚核苷酸片段质量控制分析、PCR产物质量控制分析、基因表达分析、DNA测序等。 11. 分子生物学技术在临床检验诊断应用中的问题与展望 21世纪是生命科学的世纪，分子生物学技术为人类探索生命奥秘提供了强有力的工具，大量新理论、新技术不断涌现，推动分子生物学蓬勃发展。由于一些新技术本身还不成熟、方法相对复杂、操作成本相对较高，限制了其在临床检验的常规应用。但从长远来看，随着技术和经济的不断发展，分子生物学技术将以其不可比拟的强大功能逐渐成为临床检验诊断的主要手段，因此，作为检验工作者应该积极学习分子生物学知识，掌握基本理论和基本技能，以便将来能胜任检验临床工作。 |
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