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3.3单核苷酸多态性分析(SNP)技术 随着基因组测序工作的进展，日益发现基因组中存在着数量庞大的 SNP。SNP是一种最常见的可遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占 90 %。 SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1 %。 SNP分为两种形式，一是基因编码区的 SNP，称为 cSNP；二是遍布于基因组的大量单碱基变异。SNP作为一种碱基的替换，大多数为转换，即一种嘌呤换为另一种嘌呤或一种嘧啶换为另一种嘧啶，转换与颠换之比为 2∶1。研究发现，SNP在人类基因组 CpG序列上出现最频繁，约占全部SNP的25%，而且多为 C→T，原因在于CpG中胞嘧啶残基 (C)是甲基化的，能够自发地脱氨基产生胸腺嘧啶 (T)。因此，SNP与 RFL P和 STR等 DNA标记的主要不同在于：它不再以“长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。但 SNP单个基因座的多态性很差，只有二态，为此采用多个SNP基因座进行“单倍型” 分析尤显重要。与第 1、2代遗传标记相比，SNP分析具有以下特点：(1 )SNP数量大，分布密集，平均每 1000bp就有1个 SNP。在 PKD基因内部或附近可能会找到许多 SNP，联合用于ADPKD的单倍型诊断；(2 ) SNP比STR扩增更可靠，不会产生假带；(3 )由于 SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果。 SNP的研究已受到广泛的重视，它已成为实验室和公司争夺的对象，也是人类基因组计划中的一个重要补充和研究热点。用于 RFLP、STR的技术方法，理论上均可用于 SNP的识别和检出。但印迹分析和 PCR方法，如 SSCP、DGGE等，大都需要标记和电泳，费时费力，难于自动化。近年来，采用了微阵列 DNA芯片、飞行质谱分析和变性高效液相层析法等非电泳分型技术，大大加快了SNP检测效率。 SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管没有人怀疑SNP在搜寻疾病基因方面的价值，但事实却比人们想象的要难得多。首先基因中存在着的重组破坏了SNP和增加疾病风险性的变异之间的联系，使得相关分析变得困难。有研究指出关联分析比典型的家系分析需要的样本要多得多，以便筛除错误的信号。因此只有高速率分析数千个DNA样本的新技术的出现才会使SNP分析变得真正有价值；其次，虽然关联分析对于只有一个基因位点上的缺陷等位基因的鉴定有实用意义，但这种情况又不常见，大约 90 %疾病易感基因有 1 0个以上相关突变存在，而癌症及其它一些疾病则常涉及多个基因。另外，最普遍的SNP也是最古老的，他们可以同时存在于正常人或患者中，这就意味着SNP和基因的关键突变之间的特定联系可能不存在一个特殊的模式，人们很容易错失一个很重要的联系，或者作出一个错误的联系。样本数量也是SNP应用的一个障碍。尽管大部分SNP出现在各种群体中，但是某一种SNP可能只出现在一个亚群中，一些有意义的cSNP也以相当高的比例出现在某一亚群中。所以要搜寻SNP就要尽可能地采用多种多样的大样本。专利问题也限制着SNP技术应用。由于SNP具有的新颖性、实用性和不明确性等特征，使得许多商业公司抢先获得SNP后能够对其申请专利，限制了许多研究者对它们的使用。 4．单链构象多态性分析(SSCP)技术 SSCP是一种简便快速的检测DNA或cDNA突变的技术。其技术原理和过程是：将PCR扩增到的待测DNA或cDNA片段变性，成为单链DNA，在一定条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA变性。由于单链DNA的空间构象与分子内碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳动速率不同，形成的带型则不同，故能反映出单链DNA片段的多态性。 5．DNA测序技术 将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA序列。 DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析，使临床基因诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂，一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。 6．DNA芯片技术 DNA芯片技术，实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。根据芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片和DNA微集阵列(DNA microarray)。芯片上固定的探针除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列。因此，DNA芯片又被称为基因芯片、 cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。 作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济，平行化、自动化等，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势：①基因诊断的速度显著加快，一般可于30 min内完成。若采用控制电场的方式，杂交时间可缩至1 min甚至数秒钟。②检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化。③基因诊断的成本降低。④芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。⑤因为是全封闭，避免了交叉感染；且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。 DNA芯片技术在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面应用广泛。如感染性疾病是由于病原微生物(病毒、细菌、寄生虫等)侵入机体而引起。目前已经获得一些生物的全部基因序列，包括141种病毒，几种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌、支原体M.genitalium及实验室常用的大肠杆菌等)和一种真核生物(酿酒酵母)，且数量还在增长。因此，将一种或几种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块芯片上，可快速、简便地检测出病原体，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。用DNA芯片技术可以快速、简便地搜寻和分析DNA多态性，极大地推动法医生物学的发展。比如将个体SNPs设计在一块DNA芯片上，与样品DNA杂交，即可鉴定基因的差异。人的体型、长相约与500多个基因相关，应用DNA芯片原则上可以揭示人的外貌特征、脸型、长相等，这比一般意义的DNA指纹谱又进了一步。 应用DNA芯片还可以在胚胎早期对胎儿进行遗传病相关基因的监测及产前诊断，为人口优生提供有力保证；而且可以全面监测200多个与环境影响相关的基因，这对生态、环境控制及人口健康有着重要意义。 |
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