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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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glenn_007

木虫 (小有名气)

[交流] 紧急求助:克隆蓝白斑实验出现假阳性!!!

各位大侠,请帮帮忙,我先遇到一些奇怪的现象,不知如何改进:

    我的目标片段是600—700bp,T载体链接后,转化克隆,然后蓝白斑实验筛选。挑出白色colony,摇菌,最后制备质粒。
    但是送去测序的样片却显示全部是载体序列。重复了很多次,也都是这样的结果,我现在制备质粒之前,直接做PCR,结果显示也没有目标片段的扩增。这与测序的结果一致,证明里面并没有插入片段。但是蓝白斑实验明明是有白色的colony啊,虽然少了一点,但是与蓝斑对比,确实是白色的很明显。
   
    我不知道是哪里出了问题。请大家帮帮我?
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xclj369ouc

金虫 (小有名气)

我最近也在做蓝白筛选,假阳性的比例挺大的。假阳性的可能有很多种,主要和菌的生长有很大关系,并不一定是白色就有插入片段的。相反,有些显蓝色的,却可能有插入片段,因为插入片段较短(<500bp),并且没有影响LacZ基因的读框,因此菌落就可能现蓝色或浅蓝。
8楼2008-06-08 14:44:34
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humants

金虫 (正式写手)

有可能使载体自连太严重了,
你的T载体是不是很长时间了?你做一个T载体自连实验,看一下,是不是自连率很高!如果是建议换一批T载体,
如果是新载体,自连很厉害,你可以找试剂公司让他给你换一批!

祝你好运1
2楼2008-06-05 11:12:33
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glenn_007

木虫 (小有名气)

我现在也怀疑是载体的原因,我用的载体是实验室自己配置的。刚用别人试剂盒的载体拿来试验一下。

但我还是很奇怪如果是载体自连的话,也应该是蓝斑,不应该是白斑吧。
3楼2008-06-05 11:40:13
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

晕,提了质粒不做酶切和PCR鉴定就直接测么,太浪费了吧,呵
4楼2008-06-05 11:41:05
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