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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助PCR扩增不出来的问题.....
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芕星悦

新虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR扩增不出来的问题..... 已有11人参与

最近做分子实验PCR，总是做不出来，不知道哪位大侠能够指点一下....

PCR反应总体系为20 ul，其中包含：
DNA（10 ng/ul） 3ul ；
Primers（2 uM）上下游各3ul；
Taq酶（5U/ul） 0.2ul；
dNTP（1mM） 4ul ；
10Xbuffer（含Mg2+，1Xbuffer中含2mM） 2ul；
ddH2O补齐至20ul。

该体系用做扩增叶绿体DNA时，完全没问题，但是在扩增核基因时，仅扩增出一次，就再也没扩增出来了。从扩增效果看，也并不是特别理想。以前做的时候，是用的公司提供的预混液mix，只需加入DNA、primers、Taq，拿水补齐就行了，且扩增结果稳定。现在用同样的扩增程序，可扩增结果怎么都出不来。试了很多次，更换引物（新合成的引物）、增加引物浓度（终浓度为0.3、0.5、1uM的都试过）、更换dNTP、更换DNA、增加DNA模版浓度（体系中30ng、40ng、50ng的都试过），但最终都是无结果。PCR扩增程序没问题的，因为之前用预混液做出来有结果的。只是现在没有条件了，没有再购买预混液了。

另外，不知道水是不是有问题？我做叶绿体基因的时候，扩增结果良好，扩增图谱比较清晰，但用同样的体系，只是更换引物，没有更换水，结果怎么都做不出来了，求大神帮忙.....
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1楼 2015-01-21 22:19:46
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芕星悦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 立林258369 at 2015-01-23 00:25:30
可以尝试将酶含量提高，加大模板量到100ng。预混的也是这些，可以参考一下它的配比

你们用后染色法么？琼脂糖凝胶，利用后染色法（EB为核酸染料），总感觉染色效果也不太好。你们那里用什么染色？
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15楼2015-02-02 10:32:05
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对
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2楼2015-01-21 22:46:14
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芕星悦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-21 22:46:14
我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对

因为引物浓度是2uM的，所以用了3ul，使其终浓度为0.3uM。模版的话30ng应该是足够的。
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3楼2015-01-22 00:08:21
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:21
引物和模板的浓度看起来是高了，但是如果已经对两者的浓度进行过摸索，还是没有得到结果的话，就可以考虑扩增时酶的问题（普通的Taq酶或者是热启动Taq酶）。
如果采用相同的体系，只是针对不同的DNA模板，其中一个DNA模板扩增完全没有问题，而另一个无论怎样进行体系优化也没有结果，说明问题是在DNA模板本身，是否是降解了，亦或是引物设计不合理，无法扩增。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-22 11:04:07
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