请教DEAE-FF CM-FF挂不住蛋白 - 生物科学 - 层析/纯化 - 第6页小木虫论坛-学术科研互动平台

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卢家彬

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49楼: Originally posted by 贾昕 at 2015-02-03 16:44:08
先调pH值，再调洗脱液浓度，做静态梯度实验，找到洗脱条件（pH，浓度），然后进行正式洗脱（当年多么痛的领悟）。

野生菌，不知道等电点，最近我用10mMTris-HCl（pH=8.0）平衡，目的蛋白挂上去了，不过用0.01M的盐浓度就把目的蛋白洗脱下来了，很不稳定，有时在平衡液里也有酶活。这怎么办

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51楼2015-02-04 11:44:19

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贾昕

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引用回帖:

51楼: Originally posted by 卢家彬 at 2015-02-04 11:44:19
野生菌，不知道等电点，最近我用10mMTris-HCl（pH=8.0）平衡，目的蛋白挂上去了，不过用0.01M的盐浓度就把目的蛋白洗脱下来了，很不稳定，有时在平衡液里也有酶活。这怎么办...

1.确定你的蛋白具有活性的pH范围。
2.向等量调成不同pH梯度（在酶活性范围内，盐浓度只要能吸附就可以）的缓冲液中加入等量IEC树脂和酶液，平衡一段时间后测液相酶活，找出酶刚开始脱附的pH值作为洗脱pH值。
3.在该pH下，向等量调成不同盐浓度梯度的缓冲液中加入等量IEC树脂和酶液，平衡一段时间后测液相酶活，找出酶刚开始脱附的盐浓度C1和完全脱附的盐浓度C2。
4.在该pH值下，以C1为梯度起点，C2为梯度终点进行线性洗脱，把洗脱体积设得大一些。
以上就是大概步骤了。这个方法在一本叫《Protein purification for proteomics》的书上有，不过这本书可能比较少见。
蛋白脱附并不是像许多文献上写的那样在一个浓度点突然发生的，而是有一段区间。本人当年就是被文献坑的很惨。改用上述方法后效果很好。

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52楼2015-02-04 16:42:49

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