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卢家彬

木虫 (小有名气)

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49楼: Originally posted by 贾昕 at 2015-02-03 16:44:08
先调pH值,再调洗脱液浓度,做静态梯度实验,找到洗脱条件(pH,浓度),然后进行正式洗脱(当年多么痛的领悟)。

野生菌  ,不知道等电点,最近我用10mMTris-HCl(pH=8.0)平衡,目的蛋白挂上去了,不过用0.01M的盐浓度就把目的蛋白洗脱下来了,很不稳定,有时在平衡液里也有酶活。这怎么办
51楼2015-02-04 11:44:19
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贾昕

金虫 (小有名气)


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引用回帖:
51楼: Originally posted by 卢家彬 at 2015-02-04 11:44:19
野生菌  ,不知道等电点,最近我用10mMTris-HCl(pH=8.0)平衡,目的蛋白挂上去了,不过用0.01M的盐浓度就把目的蛋白洗脱下来了,很不稳定,有时在平衡液里也有酶活。这怎么办...

1.确定你的蛋白具有活性的pH范围。
2.向等量调成不同pH梯度(在酶活性范围内,盐浓度只要能吸附就可以)的缓冲液中加入等量IEC树脂和酶液,平衡一段时间后测液相酶活,找出酶刚开始脱附的pH值作为洗脱pH值。
3.在该pH下,向等量调成不同盐浓度梯度的缓冲液中加入等量IEC树脂和酶液,平衡一段时间后测液相酶活,找出酶刚开始脱附的盐浓度C1和完全脱附的盐浓度C2。
4.在该pH值下,以C1为梯度起点,C2为梯度终点进行线性洗脱,把洗脱体积设得大一些。
以上就是大概步骤了。这个方法在一本叫《Protein purification for proteomics》的书上有,不过这本书可能比较少见。
蛋白脱附并不是像许多文献上写的那样在一个浓度点突然发生的,而是有一段区间。本人当年就是被文献坑的很惨。改用上述方法后效果很好。
52楼2015-02-04 16:42:49
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liaohongjun

铁虫 (小有名气)


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你蛋白是酸性蛋白还是碱性蛋白,如果是碱性蛋白,那么DEAE-FF在流穿中是很正常的!同时要考虑目标蛋白的浓度、透析脱盐是否充分及流速等因素!
53楼2015-03-06 15:47:34
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xulin0417

新虫 (初入文坛)


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能不能试试梯度洗脱!?梯度拉缓一点,看效果是不是好些。
54楼2015-04-10 15:47:11
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hc-material

专家顾问 (职业作家)


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怀疑透析不彻底,祝顺利。
55楼2015-08-28 16:30:00
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