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liumeng611

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[求助] 两个基因的5'和3'端序列相同长度也相同，构建载体时如何区分开二者？已有1人参与

求指教：我要构建的两个基因cDNA的5'和3'端序列是一模一样的，只有中间有若干碱基不同，需要做酵母双杂所以必须要全长的cDNA，可是设计出的引物无法区分出两个基因，两个基因大小只差4bp，电泳也区分不开，这可怎么办呢？虽然是模式植物，但目前基因组测序还不完整，想得到上下游的序列也不大可能。。

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同一个基因片段连到两个不同载体，序列就不一样了？已经有10人回复

1楼 2015-01-19 14:57:23

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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liumeng611: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 非常感谢，很详尽的解释！！ 2015-01-19 16:29:45

1.设计一对扩增全长的引物A，PCR扩增出一个基因，是两个中的一个就行；
2.测序看看扩增得到的是哪一个；
3.用点突变技术，从得到的那个基因突变出另一个基因，两个基因就4个碱基不同，点突变应该可以；
4.再设计一对引物B，引物两端要有特异性的序列，然后用引物B扩增突变得来的基因；（上载体之后引物也会翻译成蛋白，如果你不想引物翻译，那可以改造引物A：正向引物不变，反向引物加上终止密码子后接特异序列，有终止密码子引物就不表达了）
5.上载体后可以用A、B两个引物将基因分开。

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