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有人了解 two-tiered PCR method吗~求经验交流~
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| 如题，a two-tiered PCR method |
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2楼2015-01-13 11:09:10
送红花一朵 |
谢谢回答。关于two-tiered PCR method，相关文献很少，详细介绍two-tiered PCR method的文献资料几乎没有，有点无从下手。这几天查资料后想了想，我觉得PCR的关键还是引物。 关于我们实验的具体情况是，在这个实验中有两对引物。在每一对引物中，第一轮引物是普通引物+简并引物，第二轮引物则是普通引物，即普通引物在简并引物外侧(不像巢式PCR中第二轮引物在第一轮引物内侧)，而且两对引物的第二轮引物是完全一样的，它可能类似于一个标签的作用(？)。第一轮扩增只有10个循环，第二轮则是正常的35个循环。 目前这个实验已经在进行中了，体系就是普通PCR体系。在程序上我做了一些修改，第一轮采用30个循环，第二轮照旧采用35个循环。第二轮PCR模板量是根据第一轮PCR电泳结果而定的，若有条带则将第一轮PCR产物稀释50倍or100倍作模板，若没有条带则取其直接作模板，但是奇怪的是，其中一对引物的两轮PCR结果都很理想，但另一对引物，其第一轮PCR扩增有目的条带，也有非特异性扩增，第二轮PCR扩增则什么条带都没有。两对引物是同时操作的，除了引物不同，其它试剂都是同一个，不清楚问题可能出现在哪里？ 对了，还有一点不同就是另一对引物的第一轮PCR产物4℃过夜了，这个会有影响吗？ |
3楼2015-01-14 18:35:21
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【答案】应助回帖
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低调绅狮: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2015-01-19 09:34:08
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您好，很高兴。首先4℃过夜，应该是没什么大问题（但是分子实验嘛，看不见摸不着的，所以得全方面考虑）。 对于您的这一段陈述，我的理解是这样的：用两对引物PCR，一对引物两轮扩增的结果都很好，另一对引物在第二轮扩增则没有引物。（当然最后你也说了），两对引物同时操作，除了引物不同之外，其他试剂都是一样的？那这按照理论上说应该很明显呀，单一变量原则嘛，试剂相同只有引物是不同的，那不就说明问题应该在引物的身上吗（不知道是不是想表达这样的意思呢？  ）。确实，多重PCR引物的设计实为一个棘手的问题（两对也还好的 ），要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度，且不发生相互作用，扩增出来的产物又要能通过电泳分开。所以得进行优化，而优化的最重要一步就是：平衡多重PCR中每一对引物的量使之对每个靶位点都能获得足够的扩增量，大多数的问题通常都是由于这个引起的，所以最好的选择就是：逐步增加扩增产物少或者没有扩增的引物的浓度，同时减少扩增效率高的引物的浓度。只有当这个策略行不通的时候在考虑调整反应条件，例如：酶啊，镁离子的浓度啊等等。如果所有产物扩增效率都低的话，则首先考虑提高模板和酶的浓度（最好使用特异性较高的酶，如热启动Taq酶），如不行，就采用成倍增加引物浓度的方法进行降落PCR。 可能由于我的理解不是很到位，所以我就说说试试看，不知道对您是否有用。。。 |
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4楼2015-01-15 09:56:26
5楼2015-01-19 09:33:44
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6楼2015-01-19 13:09:52