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求助 重组质粒的连接转化
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| 将大小为4kb的Ac片段与去除了gus片段的Pbi121（大小为14758bp）载体相连接，使用的是MBI的连接酶，22度连接过夜，之后采用的是热激法转化到DH5感受态细胞中，涂板培养后只有一两个菌落出来，提取质粒后条带大小也只为15kb左右，酶切后的电泳图却任何条带都没有，到底是哪里出现了问题？请各位帮帮忙？ |
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2楼2008-05-30 13:29:58
3楼2008-05-30 15:29:28
4楼2008-05-30 19:25:49
5楼2008-05-30 22:28:43
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谢谢大家的帮助，不过还要请各位再给我一些指点，我使用的感受态细胞是从厂家直接订购的，以前做过一样的连接转化，平板出来的菌落很多，提取质粒电泳条带的大小还是15000左右，认为不正确所以又做了一次，结果菌落才有一两个，前后的菌落差异很大，我以为这次是正确了所以做了下酶切鉴定可是却任何条带都没出现，（酶切体系是20ul，质粒：4ul，buffer：2ul，两个酶的量各位0.5ul，加水补足）。 我实在想不出哪里出了问题。 我使用的是MBI的连接酶，使用说明书上介绍的是22度连接一个小时，如果想要增加产量可以过夜连接，所以我采用了22度连接过夜，以期获得更多的连接产物易于后期的转化 转化步骤：1）取10ul连接产物放于100ul（冰上融化）的感受态细胞中，用移液枪抽提几次后，置于冰上放置30分钟2）于42度水浴热激90秒，立即置于冰上2-3分钟3）加400ul LB液体培养基，37度振荡培养60分；4）取100ul菌液，涂布于含有卡那的LB平板上，37度倒置培养 还请大家再次的帮帮忙 谢谢了 |
6楼2008-05-31 09:28:05
7楼2008-06-01 15:37:54
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谢谢大家的帮助，不过还要请各位再给我一些指点，我使用的感受态细胞是从厂家直接订购的，以前做过一样的连接转化，平板出来的菌落很多，[/b]前后两次转化时间多久？要是两三个月，感受态细胞可能效率下降。 提取质粒电泳条带的大小还是15000左右，认为不正确所以又做了一次，结果菌落才有一两个，前后的菌落差异很大，我以为这次是正确了所以做了下酶切鉴定可是却任何条带都没出现，（酶切体系是20ul，质粒：4ul，buffer：2ul，两个酶的量各位0.5ul，加水补足）。 [/b]显然是没有连接上目的片断。 转化步骤：1）取10ul连接产物放于100ul（冰上融化）的感受态细胞中，用移液枪抽提几次后，置于冰上放置30分钟2）于42度水浴热激90秒，立即置于冰上2-3分钟3）加400ul LB液体培养基，37度振荡培养60分；4）取100ul菌液，涂布于含有卡那的LB平板上，37度倒置培养可以把全部菌液离心后保留100ul涂平板。 建议： 1、目的片断与载体重新连接，要控制二者的摩尔质量比，一般是5～10：1，常用10：1，注意是摩尔比。连接时设置对照。 2、转化时，设置对照 [ Last edited by jiwu20 on 2008-6-5 at 09:44 ] |
8楼2008-06-05 09:41:43
9楼2008-06-05 09:43:44
