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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 碱裂解法提取质粒不成功
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781055707

木虫 (著名写手)
PET32A啊,低拷贝质粒，我用试剂盒提过夜的菌液，浓度才50NG/UL，跑电泳条带才一点点。楼主要不把菌液放在100UL的PCR反应管里平邮过来，我帮你提，顺带送我点PET32A的空载。
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采菊东篱下，悠然见南山。
11楼2015-01-06 09:45:23
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
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12楼2015-01-06 13:48:58
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by aotoulan at 2015-01-06 13:48:58
用试剂盒提取我也能提取出来，3ml过夜菌提出来的浓度和你的差不多，这不试剂盒用完了只有自己配试剂提了，幸好昨天发现了别的试剂盒，几个试剂盒拼凑起来已经提出来了。只是想知道为什么这个没提出来？...

几个试剂盒拼凑起来能提出来，自己配的提不出来，试剂的PH,SDS,NAOH,H2SO4很难保证每样都好用的呀。楼主你知道试剂盒里每样化学物的作用吗？
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采菊东篱下，悠然见南山。
13楼2015-01-06 14:19:41
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
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14楼2015-01-06 15:15:33
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梦影清扬

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aotoulan: 金币+2, ★有帮助, 我想我已经找到了原因了后面试试 2015-01-07 22:53:51
看电泳图，还是有质粒提取出来的（有白色条带），PCR扩增还是可以出目的条带的，但是酶切的话还是少了。如果需要浓度高的质粒可以增加样本数。或者你要看离心取上清时有没有把沉淀也洗去了。
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15楼2015-01-07 11:05:56
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翼在天

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先，PCR的灵敏度比较高，你在之前做菌落PCR是如果直接从转化体系的平板上挑菌，可能沾染上未转入菌体的连接好的质粒，也会有目的条带出现；其次，碱抽提所得的质粒会存在一定程度的菌体DNA和RNA的污染，如果目的片段在原菌基因组中存在，那么用质粒小提所得的洗脱液进行PCR也有可能出现目的条带（以原菌DNA为模板）
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16楼2015-01-08 11:20:42
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
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17楼2015-01-08 16:15:03
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翼在天

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by aotoulan at 2015-01-08 16:15:03
谢谢你的提醒，不过同时以不含重组质粒的菌为阴性对照做菌落PCR(培养啊、体系啊等操作都一样的)，这个应该就是你说的原菌基因组情况吧，没有P出目的条带...

恩，对，那就能排除这个了。
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18楼2015-01-08 16:26:24
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米小爷

新虫 (初入文坛)
楼主 你有质粒提取的具体流程没、？
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19楼2015-01-20 15:45:56
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aotoulan

禁虫 (小有名气)
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20楼2015-01-20 17:22:21
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