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gdhuankai

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专业: 微生物生理与生物化学

[交流] 细胞培养用液的配制具体步骤与消毒方法已有1人参与

　　实验器材与生物试剂

　　干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

　　具体步骤

　　一. 水的制备

　　细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

　　二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)

　　1.溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

　　2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶，并插上针头放入高压锅内120℃消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

　　三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒

　　胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的 BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

　　1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到 7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

　　2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

　　四.青、链霉素溶液的配制与消毒

　　1. 所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。

　　2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位 /瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

　　3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100单位/ml。1单位=1微克

　　五.RPMI1640的制备与消毒：

　　1.溶解、调PH值、定容：先将微生物培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入微生物培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向微生物培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。

　　2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

　　3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

　　4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

　　5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。

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