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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Bac-to-bac杆状病毒表达系统
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马海云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 喜气洋洋 at 2014-12-28 09:12:31
bacmid提取后做一个酶切，0.7%的胶，100v跑跑看，验证一下，有可能提取的不是bacmid呢，我遇到过一次

这个酶就是设计目的基因带的酶切位点的那个酶吗？
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11楼2014-12-29 08:35:05
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李小同

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
马海云: 金币+1, ★有帮助 2015-01-13 09:57:50
提取BACMID后我们都是要用M13引物再检测一遍的，跑胶很难看见东西，都是HELPER
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12楼2014-12-29 16:39:04
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 马海云 at 2014-12-29 08:35:05
这个酶就是设计目的基因带的酶切位点的那个酶吗？...

EcoR1,Hind3单酶切，也可以pcr看看

[ 发自小木虫客户端 ]
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学海无涯懂做舟
13楼2014-12-29 21:53:28
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wangjy108

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
马海云: 金币+5 2015-01-13 09:58:01
重组的bacmid浓度确实低，提取之后我们一般用PCR检测，确定目标基因重组上去之后做转染。可以适当延长P1的收毒时间，多培养几天，然后扩增制备P2、P3，使用滴度合适的病毒代次，蛋白表达量低的话可以增加表达体系的量或者提高细胞密度。
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silly stupid Ph.D candidate
14楼2015-01-12 19:55:21
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dalian0725

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 喜气洋洋 at 2014-12-29 21:53:28
EcoR1,Hind3单酶切，也可以pcr看看
...

同学，我现在在做用Bac-to-Bac表达蛋白，但是做到提取杆粒转染昆虫细胞sf9的时候就老失败，不知道是哪方面的原因。
我用的载体是pFastBac1，用碱裂解的方法手提杆粒，但是有四五条带，在最下边还有特别亮的RNA带。然后采用脂质体转染Sf9，转染时培养液用的是无抗无血清的Grace培养液。（Grace培养液是有Grace’s insect cell culture medicine粉末，水解乳蛋白 ，酵母浸出液，碳酸氢钠配制而成）。
那你是怎么做的呢
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15楼2015-11-21 19:51:51
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dalian0725

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wangjy108 at 2015-01-12 19:55:21
重组的bacmid浓度确实低，提取之后我们一般用PCR检测，确定目标基因重组上去之后做转染。可以适当延长P1的收毒时间，多培养几天，然后扩增制备P2、P3，使用滴度合适的病毒代次，蛋白表达量低的话可以增加表达体系的 ...

同学，我现在在做用Bac-to-Bac表达蛋白，但是做到提取杆粒转染昆虫细胞sf9的时候就老失败，不知道是哪方面的原因。
我用的载体是pFastBac1，用碱裂解的方法手提杆粒，但是有四五条带，在最下边还有特别亮的RNA带。然后采用脂质体转染Sf9，转染时培养液用的是无抗无血清的Grace培养液。（Grace培养液是有Grace’s insect cell culture medicine粉末，水解乳蛋白 ，酵母浸出液，碳酸氢钠配制而成）。
你是怎么做的？你觉得我是啥有问题呢？
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16楼2015-11-21 19:56:54
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