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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lxxlxxhappy

铁虫 (初入文坛)

[交流] 急PCR,多次P不出,别人建议用两步PCR法,急求原理!!!!!!!!!

急PCR,多次P不出,别人建议用两步PCR法,先用低退火温度做10cycle,再用高退火温度20cycle,为什么这样做?急求原理???????????不胜感激
[search]PCR[/search]
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petersonswh

银虫 (初入文坛)

我理解你的心情

★ ★ ★ ★ ★
lixiaoyi1981(金币+5,VIP+0):呵呵,无私分享,值得鼓励。谢谢
当时我是新手时也一样,有些就是P不出来,后来问了问高人加上自已的TRY,现在也算有些经验 了,
当你从CDNA LIBRARY 扩增目的片段时,小于2KB还行,大的话是不容易,因为是从上万个TRANSCRIPTS 里扩一个。这时侯两步法会解决不少问题,我的几个基因就是用它搞定的。

原理是

比如PRIMER ANNEALING TEMP 是60 通常我们是用低于5度,而这时可以先用低于8到10度(50-52OC),10 个CYCLE,目 的是先来一部分初筛,降低标准尽可能找到一些TARGETS.
后边的20 个CYCLE 再升至55,就是说用上十个CYCLE 中的产物来扩,产物跑胶后会看到目的片段的,实在不行也只好让老板多花的银子买CDNA 了。GOOD LUCK.
多伦多
3楼2008-05-24 06:22:05
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nmnqwy

银虫 (正式写手)

多大片段?退火温度多少?联系我nmnqwy@163.com
2楼2008-05-23 18:08:39
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