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lxxlxxhappy

铁虫 (初入文坛)

[交流] 急PCR，多次P不出，别人建议用两步PCR法，急求原理！！！！！！！！！

急PCR，多次P不出，别人建议用两步PCR法，先用低退火温度做10cycle，再用高退火温度20cycle，为什么这样做？急求原理？？？？？？？？？？？不胜感激
[search]PCR[/search]
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1楼 2008-05-23 17:39:42
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petersonswh

银虫 (初入文坛)

我理解你的心情

★ ★ ★ ★ ★
lixiaoyi1981(金币+5,VIP+0):呵呵，无私分享，值得鼓励。谢谢
当时我是新手时也一样，有些就是P不出来，后来问了问高人加上自已的TRY,现在也算有些经验 了，
当你从CDNA LIBRARY 扩增目的片段时，小于2KB还行，大的话是不容易，因为是从上万个TRANSCRIPTS 里扩一个。这时侯两步法会解决不少问题，我的几个基因就是用它搞定的。

原理是

比如PRIMER ANNEALING TEMP 是60 通常我们是用低于5度，而这时可以先用低于8到10度（50-52OC)，10 个CYCLE，目 的是先来一部分初筛,降低标准尽可能找到一些TARGETS.
后边的20 个CYCLE 再升至55,就是说用上十个CYCLE 中的产物来扩，产物跑胶后会看到目的片段的，实在不行也只好让老板多花的银子买CDNA 了。GOOD LUCK.
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多伦多
3楼2008-05-24 06:22:05
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nmnqwy

银虫 (正式写手)
多大片段？退火温度多少？联系我nmnqwy@163.com
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2楼2008-05-23 18:08:39
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