应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的基因和表达载体连接不上，求指导！！！
162/2返回列表上一页12
查看: 2218  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-08 19:02:09
请教了一下师兄，找到问题所在了。是pcr产物里面污染了质粒，我这次提的Puc57质粒，有好几条带（6-7条），其中最下面的淡淡的那条带跟pcr产物带几乎在一个位置。赤裸裸的污染啊！！！也就是说我的目的片段跟pyes2根 ...

改变连接体系了，只长了两个菌，也都不对。。。。哎，真是要疯了
赞一下 回复此楼
11楼2014-12-11 13:23:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-11 13:21:58
不太明白怎么回事。。。形成的多聚体是线性的吧？转化进去以后可以自己形成想要构建的载体吗？...

没有问题，重叠PCR已经形成环了，实验室已经运用的很熟练了，而且这种方法对感受态的要求很低，网上有很多关于重叠pcr，或多片段直接组装的文章，你可以查查，说的很明白
赞一下 回复此楼
12楼2014-12-11 20:12:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有一种解决的办法，把你的PCR产物双酶切后连到一个KANA抗性的载体上，并且这个载体在4k以上，方便酶切（这样即便是你回收的片段里有质粒污染，但污染进去的质粒是AMP抗性的，在KANA抗性的平板上不会长的），然后再酶切回收一次这个片段，连接pyes2载体，这时如果你的酶切片段有质粒污染（可能性比较低），但污染质粒是KANA抗性的，在AMP抗性的平板上是不会长的，一切问题都解决了
赞一下 回复此楼
13楼2014-12-11 20:22:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2014-12-09 11:19:18
弄明白了就好。...

还是没有做出来，郁闷，一个多月了，连载体都构建不好，真够失败的
赞一下 回复此楼
14楼2014-12-12 08:54:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wanglei512 at 2014-12-11 20:12:32
没有问题，重叠PCR已经形成环了，实验室已经运用的很熟练了，而且这种方法对感受态的要求很低，网上有很多关于重叠pcr，或多片段直接组装的文章，你可以查查，说的很明白...

我现在想的是，即使有puc57的污染，只要我的目的片段跟载体连上了，那也应该长出东西来吧？但是一直没有连上，这里应该还是有问题的。
     我们实验室没有定量的设备，而且我胶回收做的一直很不好，我现在怀疑是不是片段跟目的载体的浓度太低导致的。。。
     你提供的两种方法都很好，在此感谢！！！
赞一下 回复此楼
15楼2014-12-12 09:28:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘书杰

金虫 (小有名气)
楼主你好，我做实验需要用到载体PYES2，不知道你们实验室能提供不，可以购买，或者给说下你们在哪购买的也行，老师崔的紧，还望你能帮助，谢谢
赞一下 回复此楼
16楼2015-03-31 11:38:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 HSY郡主 的主题更新
162/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭