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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的基因和表达载体连接不上，求指导！！！
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-08 19:02:09
请教了一下师兄，找到问题所在了。是pcr产物里面污染了质粒，我这次提的Puc57质粒，有好几条带（6-7条），其中最下面的淡淡的那条带跟pcr产物带几乎在一个位置。赤裸裸的污染啊！！！也就是说我的目的片段跟pyes2根 ...

改变连接体系了，只长了两个菌，也都不对。。。。哎，真是要疯了
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11楼2014-12-11 13:23:18
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wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-11 13:21:58
不太明白怎么回事。。。形成的多聚体是线性的吧？转化进去以后可以自己形成想要构建的载体吗？...

没有问题，重叠PCR已经形成环了，实验室已经运用的很熟练了，而且这种方法对感受态的要求很低，网上有很多关于重叠pcr，或多片段直接组装的文章，你可以查查，说的很明白
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12楼2014-12-11 20:12:32
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有一种解决的办法，把你的PCR产物双酶切后连到一个KANA抗性的载体上，并且这个载体在4k以上，方便酶切（这样即便是你回收的片段里有质粒污染，但污染进去的质粒是AMP抗性的，在KANA抗性的平板上不会长的），然后再酶切回收一次这个片段，连接pyes2载体，这时如果你的酶切片段有质粒污染（可能性比较低），但污染质粒是KANA抗性的，在AMP抗性的平板上是不会长的，一切问题都解决了
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13楼2014-12-11 20:22:27
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2014-12-09 11:19:18
弄明白了就好。...

还是没有做出来，郁闷，一个多月了，连载体都构建不好，真够失败的
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14楼2014-12-12 08:54:16
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wanglei512 at 2014-12-11 20:12:32
没有问题，重叠PCR已经形成环了，实验室已经运用的很熟练了，而且这种方法对感受态的要求很低，网上有很多关于重叠pcr，或多片段直接组装的文章，你可以查查，说的很明白...

我现在想的是，即使有puc57的污染，只要我的目的片段跟载体连上了，那也应该长出东西来吧？但是一直没有连上，这里应该还是有问题的。
     我们实验室没有定量的设备，而且我胶回收做的一直很不好，我现在怀疑是不是片段跟目的载体的浓度太低导致的。。。
     你提供的两种方法都很好，在此感谢！！！
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15楼2014-12-12 09:28:39
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刘书杰

金虫 (小有名气)
楼主你好，我做实验需要用到载体PYES2，不知道你们实验室能提供不，可以购买，或者给说下你们在哪购买的也行，老师崔的紧，还望你能帮助，谢谢
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16楼2015-03-31 11:38:03
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