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HSY郡主

新虫 (初入文坛)

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5楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-08 19:02:09
请教了一下师兄,找到问题所在了。是pcr产物里面污染了质粒,我这次提的Puc57质粒,有好几条带(6-7条),其中最下面的淡淡的那条带跟pcr产物带几乎在一个位置。赤裸裸的污染啊!!!也就是说我的目的片段跟pyes2根 ...

改变连接体系了,只长了两个菌,也都不对。。。。哎,真是要疯了
11楼2014-12-11 13:23:18
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wanglei512

金虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by HSY郡主 at 2014-12-11 13:21:58
不太明白怎么回事。。。形成的多聚体是线性的吧?转化进去以后可以自己形成想要构建的载体吗?...

没有问题,重叠PCR已经形成环了,实验室已经运用的很熟练了,而且这种方法对感受态的要求很低,网上有很多关于重叠pcr,或多片段直接组装的文章,你可以查查,说的很明白
12楼2014-12-11 20:12:32
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有一种解决的办法,把你的PCR产物双酶切后连到一个KANA抗性的载体上,并且这个载体在4k以上,方便酶切(这样即便是你回收的片段里有质粒污染,但污染进去的质粒是AMP抗性的,在KANA抗性的平板上不会长的),然后再酶切回收一次这个片段,连接pyes2载体,这时如果你的酶切片段有质粒污染(可能性比较低),但污染质粒是KANA抗性的,在AMP抗性的平板上是不会长的,一切问题都解决了
13楼2014-12-11 20:22:27
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)

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8楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2014-12-09 11:19:18
弄明白了就好。...

还是没有做出来,郁闷,一个多月了,连载体都构建不好,真够失败的
14楼2014-12-12 08:54:16
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HSY郡主

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by wanglei512 at 2014-12-11 20:12:32
没有问题,重叠PCR已经形成环了,实验室已经运用的很熟练了,而且这种方法对感受态的要求很低,网上有很多关于重叠pcr,或多片段直接组装的文章,你可以查查,说的很明白...

我现在想的是,即使有puc57的污染,只要我的目的片段跟载体连上了,那也应该长出东西来吧?但是一直没有连上,这里应该还是有问题的。
     我们实验室没有定量的设备,而且我胶回收做的一直很不好,我现在怀疑是不是片段跟目的载体的浓度太低导致的。。。
     你提供的两种方法都很好,在此感谢!!!
15楼2014-12-12 09:28:39
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刘书杰

金虫 (小有名气)

楼主你好,我做实验需要用到载体PYES2,不知道你们实验室能提供不,可以购买,或者给说下你们在哪购买的也行,老师崔的紧,还望你能帮助,谢谢
16楼2015-03-31 11:38:03
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