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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药剂学 » 关于胰岛素体内样品处理方法
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小小肥猫

新虫 (小有名气)

[求助] 关于胰岛素体内样品处理方法 已有2人参与

以下是我在文献中看到的胰岛素体内样品处理方法：
   A volume of 10ml of plasma sample was pipetted into a 5-ml test tube and diluted to 1 ml with PBS (pH 7.4) to permit sample to be analyzed under
the sample conditions. The sample was extracted with 1ml dichloromethane by rotating for 5 min. The tube was
centrifuged briefly to separate the layers and then immersed in dry-ice bath. The supernatant layer was decanted and 0.8 ml of the organic phase was transferred toanother tube. To the organic extract 130ml of 0.05 N HCl was added for back-extraction. After shaking and centrifugation the organic layer was evaporated under a stream of nitrogen and a 100-ml aliquot was injected into the HPLC.

      取10μl血浆样品加入到5mlEP管中，再加入1mlPBS（7.4），加入1ml二氯甲烷萃取，涡旋5min，简单的离心分层，置于干冰浴中，除去上清液，取0.8ml有机层转移至另一EP管，加入130μl 0.05N HCl反萃取有机层，涡旋和离心后，有机层在氮气流下吹干，取100μl等分样品进样。
问题：1.在该处理方法中，加入7.4PBS、二氯甲烷、0.05HCL的作用分别是什么？
          2.这样提取分离的原理是什么？是根据蛋白质等电点吗还是其他什么？
          3.这样的提取分离方法能将胰岛素与血浆蛋白分离开吗？
          4.是直接吹有机层吗？吹的程度怎么掌握？
  
       请各位大神给予指点！！！
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1楼 2014-12-02 19:12:43
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小小肥猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 小小肥猫 at 2014-12-04 10:48:55
真是解释的太太太太透彻啦！感谢感谢！第一次做蛋白质类的药，一头雾水啊，您真是帮了我大忙啦，3Q！...

又想了一下，关于ph7.4磷酸盐的作用，还是有点混乱，生理条件下Ph也是7.4左右，那如果胰岛素在这个条件下呈分子状态，那在生理条件下也成分子状态吗？又有点蒙圈。。。
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16楼2014-12-05 11:24:04
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yuecen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小小肥猫: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-12-04 10:52:24
胰岛素等电点为5.35-5.45，所以采用PH7.4的磷酸盐缓冲液调节血浆样品至中性，使胰岛素呈分子状态，用二氯甲烷萃取，再用0.05HCL反提至水相。个人认为应该能分开，不妨试试，至于有机层要尽量吹干，那个沸点低好吹干，因为要进样的是水相。吹的程度只要不把溶液吹出来就行了，水相是很难吹干的，所以不用担心啦
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2楼2014-12-02 23:12:26
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voyager88

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不同的胰岛素所需溶剂不同，一般回收率都很低，或者存在变性。目前药动学都是使用ELISA的方法测的
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微信公众号：Pharmaguider（药事纵横），主页：www.pharmaguider.cn
3楼2014-12-03 14:36:19
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小小肥猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuecen at 2014-12-02 23:12:26
胰岛素等电点为5.35-5.45，所以采用PH7.4的磷酸盐缓冲液调节血浆样品至中性，使胰岛素呈分子状态，用二氯甲烷萃取，再用0.05HCL反提至水相。个人认为应该能分开，不妨试试，至于有机层要尽量吹干，那个沸点低好吹干 ...

太感谢您的解答！还是有点不明白，胰岛素等电点5.35左右，在PH7.4条件下，它失去水化层，不是呈负离子状态么？加磷酸盐缓冲液属于盐析沉蛋白原理吗？还是什么原理呢？二氯甲烷是有机溶剂，胰岛素怎么进入到有机溶剂层的呢？最后又怎么回到水层的呢？还有二氯甲烷的密度比水大，它在下层，水在上层，直接插到水层下面吹吗？还是要怎么吹呢？每一步都是问题，希望您能帮帮我呀！拜托拜托！
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4楼2014-12-03 21:24:50
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