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构另一个单倍型的重组质粒 一直构不好
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我有一个质粒一直构不出来。它的另一个单倍型质粒已经构好。 外源目的片段有500bp。用的载体是pGL3-promoter ,酶切位点是 xho1和kpn1。 酶切反应： Buffer: 5ul PCR product/ pGL3-promoter 5000ng kpn1 5ul xho1 5ul 水补足到50ul。 酶切后的 pGL3-promoter进行sap处理 。跑胶回收后酶连，22度，过夜。酶连时，外源目的片段与载体的摩尔比是4：1。 用的酶都是thermo的。但是挑的单克隆都是空载体 做了不下五次 ，扩目的片段的引物也重新设计过一次,也换过酶切位点，都是空载体。扩的目的片段，我送去测序，没问题，载体也是切开的。最让人费解的是它的另一个单倍型我一次就构好了，两个单倍型有15个snp位点，我设计的酶切位点和引物是避开了这15个snp位点的。目的片段就是连不进去 请高手赐教 ！ |
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