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1楼 2008-05-15 12:23:55

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可以先做成石蜡切片,再进行HE染色

先做成蜡切片.
石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
　　1.取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构
　　2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。
　　3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。
　　4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。
　　5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。
　　6.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。
　　7.贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
　　8.切片脱蜡及水化干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。
　　9.染色染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。
　　10.切片脱水、透明和封片染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
　　石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成1个周期，但切片可长期保存，供教学、科研及病理诊断及复察，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天）。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片，但所显示的形态结构却不如前者，因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断。近些年来，在病理常规制片过程中采用了微波技术，从而大大缩短了制片过程，而且对形态结构并没有影响。微波是一种波长很短、频率却很高的高频电磁波［波长为1米～1毫米，频率为300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）］。组织经微波辐射后加速组织内部分子的高速运动，以使液体的运输加快，增加弥散、渗透和交换效率，从而加速组织的固定、脱水、透明、包埋和染色各个环节。例如常规福尔马林固定需数小时～1天，而且能引起组织收缩及某些抗原成分不同程度的受到破坏，微波固定仅需1～2分钟，且可减少抗原的丢失和损害。选择适当的档次（功率）、辐射时间和温度是极为重要的。目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段，许多技术应用环节尚需进一步摸索。
文章来源：http://blog.sina.com.cn/s/blog_4a527d92010006ux.html

实验一、切片制作法（石蜡切片法）
一、实验目的：
通过对材料的固定、脱水透明、浸蜡、包埋、切片等实验操作，了解石蜡切片的基本过程，掌握石蜡切片的制作方法。
二、实验准备：
1．用具小标本瓶，指管，眼科镊子，蜡杯，载玻片，毛笔，蜡铲，刀片，量筒（10）毫升，漏，滴管，酒精灯，小木块，切片木框，切片盒，吸水纸，标签纸，切片刀，熔蜡箱，展片台，真空泵，解剖针。
2．器皿的清洗
指管的清洗：切片所用的载玻片必须洗得很干净，否则切片容易脱落。新的载玻片用洗液浸泡半天取出，用自来水冲洗后，用纱布擦干净，放入盒内备用。擦拭时应捏住玻片两端的边缘操作，手指勿与玻片的表面接触，以免手指上的脂肪沾污玻片。
盖玻片的擦洗：新的盖片可放入95%酒精内浸泡数十分钟，或用洗液浸泡。注意盖片要一片片投入，使盖片的二面都接触到液体，浸泡后，水冲洗干净后再放入95%酒精中浸泡，然后用干净白布擦拭。擦拭时应注意，手指不能接触玻面，应以左手拇指和食指夹持盖片，右持布趁酒精未干时，一一擦拭之。
3．实验需用药品及其配制
70%、85%、95%、100%的酒精，
二甲苯，甘油蛋白，
固定液，石蜡。
○1各种浓度酒精配制
实验室常以95%酒精来配制各种低浓度的酒精，因100%纯酒精系由95%酒精再蒸馏而成，价格昂贵，一般不用于稀释。
配制方法：
配70%酒精时，可取95%酒精70毫升再加入蒸馏水25毫升即得。一般遵照以下原则：无论用任何浓度的酒精稀释时，即稀释多大浓度就取多少毫升的酒精，然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即可。
○2固定液的配制
采用卡诺氏醋酸酒精固定液，醋酸用冰醋酸，酒精用纯酒精，体积比为醋酸：酒精=1：3。注意须现配现用。
取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合，至均匀为止。加入约为1%量的麝香酚小块，借以防止微生物的侵入和腐败。放入冰箱备用。
三、实验材料：蚕豆根尖或洋葱根尖等。
四、实验步骤：
取材固定发芽的蚕豆，当其根尖长到一粒米大小时，用刀片切下来，立即投入盛有固定液体的标本瓶中，贴上标签，注明固定日期、固定液名称。固定4—12小时。固定剂的用量一般为材料的10—15倍或稍多，同一标本管中的材料不宜太多，因组织在固定过程中，水分或其他溶解物渗出后会影响固定剂的浓度。卡诺固定液渗透力及凝固作用很强，是一种比较激烈的固定液适宜固定DNA和RNA。脂肪及类脂体被溶解，收缩较少，对材料无硬化作用，对染色无不良影响。
2．洗涤倒出固定液，加入70%酒精，隔数小时后再换一次至二次，如不及时使用，可放入冰箱保存。如间隔时间较长，可在酒精中加入适量甘油，再放入冰箱中保存。
3．脱水与透明将材料从70%酒精中取出，顺序放入85%乙醇 95 %乙醇 100%乙醇 100%乙醇
二甲苯1：乙醇4（纯）二甲苯2：乙醇1 二甲苯4：乙醇1
二甲苯二甲苯二甲苯然后透蜡。脱水和透明时的注意点：
○1在85%酒精内组织可保留较久，如果当天来不及做完，可暂保存一晚，第二日再做。
○2每更换一次酒精要用吸水纸把根尖吸干，免得把低浓度酒精和水分带到高浓度酒精中去，这样脱水可干净。
○3组织放入二甲苯后，待组织块透明后，即可透蜡。真空抽气是为了加速组织透明，在真空情况下，二甲苯容易透入组织。如不抽气，组织在二甲苯中停留时间须在半小时以上。
4．透蜡
○1在透蜡以前，先做好准备工作，选取适当熔点的石蜡，熔化，分装在（1）号、（2）号、（3）号三个蜡杯内，置入熔蜡箱（55—60℃）。另外再准备一杯石蜡，供包埋用，也置于熔蜡箱内，一定要控制好熔蜡箱的温度，保持恒定。
○2将已透明的蚕豆根尖从二甲苯中取出，放入蜡杯（1）蜡杯（2）蜡杯（3）半小时后，即可包埋。
5．折纸盒按组织之大小折成纸盒，盒上注明材料名称，切片方向等。
6．包埋
○1准备好包埋用的吸管，小镊子，放入熔蜡箱内，使之温热。
○2用温热吸管吸热石蜡注入纸盒内，用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置。
○3将纸盒一半浸入冷水中，待表面石蜡凝成一层膜后，将纸盒迅速全部浸入冷水中，待石蜡全部凝结变硬即可取出。
7．修切蜡块把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形，注意勿太靠近组织，让组织四周留有少许石蜡。蜡块两边必须切成平行的直线，以免切下的蜡条弯曲。
8．固定蜡块取小木块，用蜡铲加上热石蜡，再熔化蜡块底面，粘于小木块上，冷却后装在切片机上。
9．切片在开始切片前，先熟悉切片机的构造和用法，装上切片刀，注意刀的倾角不宜过大，亦不宜过小，大致上以20—30度为宜。如倾角过大，则切片上卷，过小，则切片皱起。
切片时应做到下列各点：
○1调整刻度指针到要求的厚度，一般要求5—8υ。切片刀要拭净。
○2用右手摇切片机转轮，左手持毛笔托住蜡带。转动切片机时不可太快，用力宜均匀，不可时快时慢。防止机器震动太厉害，以致切片厚薄不均匀。
○3用毛笔托住蜡带，放在切片盒内。
切片时如出现各种问题，应找出原因加以解决，一般有以下几种原因：
○1切片不能形成蜡带：是室温过低或石蜡过硬，蜡边过小或不平所致，这时应提高室温，或在切片机旁点燃酒精灯。
○2蜡带弯曲：蜡块上下不平行，刀钝，蜡块不与刀刃平行，均可产生此现象。
○3蜡片卷起：刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬，蜡片均会卷起。
○4蜡片易粘在切片刀上或蜡片皱缩：室温过高或石蜡太软所致，用冷水或冰块冰一下即可。刀的角度过小，也能使切片皱缩。
○5蜡片厚薄不一：刀或蜡块没有固定牢，切片机磨损或发生故障。
○6蜡片出现裂隙或碎裂：组织浸蜡不足，或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久，组织已发脆。
○7蜡片出现纵裂口：刀有缺口或石蜡内有硬物质如钙盐物质，或刀口不洁。
○8蜡块底面成白色：由于刀口的角度过小，被刀碰撞的结果。
10．展片、贴片
○1准备好展片台，使温度保持在比包埋石蜡的熔点低5—6℃，如包埋石蜡的熔点为53℃，则水温宜在48℃左右。如果温度过低，则展片费时过长；反之温度过高，石蜡会熔化。
○2取沼净的载玻片涂以甘油蛋白：
以玻棒尖端稍稍蘸取甘油蛋白一滴，轻轻滴于载玻片中央，然后以洗净的手指加以涂布，涂布的面不宜太广，而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多，否则，会形成白膜，妨碍观察。
○3在涂有甘油蛋白的载玻片上滴二滴蒸馏水，用也片将蜡带切成适当长度的片段，以小镊子夹取蜡带，使浮在玻片的水上，摆正位置（一般稍偏于玻片的一端，留下地位可以粘贴标签）。然后把玻片放在展片台上，蜡带受热即自动展开，也可用解剖针轻轻拉开。待蜡片完全展平后，用吸水纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡，否则在展片时气泡会扩大，影响以后镜检。
○4蜡片在载玻片上展开后，即取下放在切片木框上，让其自然干燥，或置入37℃温箱内干燥。
○5干燥的片子留待下次实验用。

下面是HE染色.

一、HE染液的配制：
1、 Harris苏木素：称取苏木素精 1g
一氧化汞 0.5g
硫酸铝钾 20g
量取无水乙醇 10ml
蒸馏水    200ml
苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。
2、0.5%伊红(水溶性)：称取伊红    0.5g
量取 95%乙醇 25ml
蒸馏水 75ml
先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。
3、1%盐酸水溶液：
盐酸    3ml
蒸馏水 297ml
混匀，白色试剂瓶保存。
4、中性树胶封片剂：
      往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量
用吸管调匀，有一定粘稠度即可。

试剂二甲苯    1瓶       Harris苏木素染液
无水乙醇 2瓶       1%盐酸水溶液
95%乙醇 2瓶       0.5%伊红(水溶性)染液
中性树胶封片剂
二、染色步骤
  1、电吹风吹片或烤片，至溶蜡；
2、入二甲苯（I）中脱蜡5分钟，用吸水纸吸干液体；
3、入二甲苯（II）中脱蜡10分钟（切片透明），用吸水纸吸干液体；
4、入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；
5、入100%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体；
6、入95%乙醇3分钟；
7、入流水2分钟，用吸水纸吸干水分；
8、 Harris苏木素染色 4~8分钟；
9、自来水稍洗；
10、1%盐酸水溶液分化5~10秒（切片由蓝变红）；

11、自来水洗返蓝15~30分钟；
12、0.5%伊红(水溶性)染色30秒~1分
13、95%乙醇（I）脱水5分钟，用吸水纸吸干液体；
14、95%乙醇（II）5分钟，用吸水纸吸干液体；
15、入100%乙醇（I）5分钟，用吸水纸吸干液体；
16、入100%乙醇（II）2分钟，用吸水纸吸干液体；
17、入二甲苯（I）中透明2--3分钟，用吸水纸吸干液体；
18、入二甲苯（II）中透明5分钟；
19、中性树胶封片。
20、镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。
三、注意事项
1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。
2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。
3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。
4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。

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2楼2008-05-30 21:25:35

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luzheng79

应助: (幼儿园)
在线:
虫号: 550482

我做过别的组织

我做过肝,肠,胃,肌肉.胚胎,没有做过心脏的.

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3楼2008-05-30 21:29:18

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