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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

[求助] 新虫虫关于蛋白质标记的问题~有没有不受温度影响的标记或者染色蛋白质的方法

各位虫大侠~我是个新手最近在考虑想做蛋白质的标记,然后对它进行加热,在加热过程中用光镜、透镜或者扫镜等观察这个蛋白质在加热过程中的一系列形态上的变化,想请问下有木有什么好的染色或者标记的方,或者标记试剂,可以不受加热的影响?(加热温度大概在20-70度)【ps:这个蛋白质可能在加热过程中发生凝集,或者断裂成已知的两部分】
本人是刚进实验室的菜鸟,最近查了不少文献,大多数荧光标记都用的免疫荧光标记,但是我的蛋白需要加热看各种变化,用免疫的方法标记感觉会受到加热的影响啊~~~
求各位大侠帮忙啊~~~
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以考虑一下蛋白组学双向电泳里采用的Cy2,3,5
2楼2014-11-21 21:09:49
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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-11-21 21:09:49
可以考虑一下蛋白组学双向电泳里采用的Cy2,3,5

谢谢回复我对这个不是很懂,你是说不做双向电泳,只用里面的Cy2 Cy3 Cy5进行标记吗?我这个蛋白质需要后面和其他蛋白质一起加热然后看它在其他蛋白质存在的情况下加热时的变化,如果用Cy2 Cy3 Cy5标记的话,其他蛋白质是不是也会被标记上呀?我是想只标记这一种蛋白
3楼2014-11-22 14:43:02
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wlq474797805 at 2014-11-22 14:43:02
谢谢回复我对这个不是很懂,你是说不做双向电泳,只用里面的Cy2 Cy3 Cy5进行标记吗?我这个蛋白质需要后面和其他蛋白质一起加热然后看它在其他蛋白质存在的情况下加热时的变化,如果用Cy2 Cy3 Cy5标记的话,其他 ...

对,我说的就是只用那个染料。
如果你想做的是在ABCDEF...蛋白的混合体系中,只将A特异性标记,那可能只有免疫标记可以达到这个目的了。或者用亲和层析,将A纯化出来,标记了之后再放回去。
4楼2014-11-23 09:09:51
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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-11-23 09:09:51
对,我说的就是只用那个染料。
如果你想做的是在ABCDEF...蛋白的混合体系中,只将A特异性标记,那可能只有免疫标记可以达到这个目的了。或者用亲和层析,将A纯化出来,标记了之后再放回去。...

但是免疫标记应该有温度的限制吧?
我的温度范围在20-70之间,免疫标记是不是会受影响呀?
另外我这个蛋白在加热过程中还会发生断裂。。。是不是也有影响?
不过我在网上有查到这个蛋白断裂后的两个部分的免疫标记物,只是不知道能不能在这样的高温下使用?
或者可不可以在整个观察过程中,同时用断裂前和断裂后两种免疫标记物标记,在它加热过程中断裂前后分别自动和环境中相应的标记物结合?(我这个想法是不是太天真了。。。)

额,我比较凌乱。。。
5楼2014-11-23 10:51:15
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-11-21 21:09:49
可以考虑一下蛋白组学双向电泳里采用的Cy2,3,5

是的

[ 发自小木虫客户端 ]
啊木
6楼2014-11-23 19:14:08
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wlq474797805 at 2014-11-23 10:51:15
但是免疫标记应该有温度的限制吧?
我的温度范围在20-70之间,免疫标记是不是会受影响呀?
另外我这个蛋白在加热过程中还会发生断裂。。。是不是也有影响?
不过我在网上有查到这个蛋白断裂后的两个部分的 ...

如果看加热过程会不会生成断裂产物,并且断裂产物都有免疫标记物,那可以做个western
7楼2014-11-23 20:38:59
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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-11-23 20:38:59
如果看加热过程会不会生成断裂产物,并且断裂产物都有免疫标记物,那可以做个western...

我还是个菜鸟,只看师兄做过1次western blot,查了一下 里面有一个样品处理步骤是在100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白,这样的话温度应该没有问题了,可是感觉做western的目的是在电泳之后看这个蛋白质在跑电泳的各种蛋白里面的存在和表达情况吧?我这个主要是想看这个蛋白在加热过程中在光镜、透镜和扫镜下观察各种形态和功能结构的变化情况~用western是不是只能看存在哇?
8楼2014-11-23 21:36:09
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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-11-23 20:38:59
如果看加热过程会不会生成断裂产物,并且断裂产物都有免疫标记物,那可以做个western...

而且蛋白质加热变性之后会凝固吧?加热了就没办法跑电泳了吧(⊙o⊙)…
9楼2014-11-23 21:37:29
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wlq474797805

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by billtsu at 2014-11-23 19:14:08
是的
...

可以具体地讲一下吗?不是很懂
10楼2014-11-23 21:38:48
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