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【求助】微生物磷脂脂肪酸测定分析方法（PLFA）
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急求微生物磷脂脂肪酸（PLFA）测定分析方法的具体步骤 刚步入研究生活，各方面搜集资料的能力还有限，要开题了，比较头大。 现在需要确定实验计划了，要测PLFA。上网查了，发现各实验方法都有不一样的地方，现想寻求一种已实验过的较成熟方法。 谢谢各位学术哥哥姐姐了~~ |
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2楼2012-10-23 15:24:37
3楼2012-11-05 17:01:19
shouhuweilai
木虫 (著名写手)
- 应助: 38 (小学生)
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4楼2012-11-05 17:25:31
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5楼2012-11-29 18:55:24
【答案】应助回帖
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方法一： 1) 取 5 g（精确至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。 2) 向离心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜。 3) 4000 r/min 室温离心 10 min，用无菌一次性吸管小心吸掉上清液，下层用滤 纸过滤至锡纸包裹的小三角瓶中，高纯氮气吹干。 4) 用氯仿冲洗小柱，将活化后的硅胶（事先在 105℃烘干 1h，冷却至室温）加 一定量的氯仿浸泡，用胶头吸管吸入柱中，注意滴加过程要缓慢，不要产生 气泡，并保持柱子液面水平，上层氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸， 底部连接橡皮管，并用夹子旋紧静置 1~2h。 5) 待柱子稳定后再用氯仿小心重洗柱子，在样品三角瓶中加 300 μL 氯仿溶解样 品，用吸管转移至柱中，分别用 10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 无水 甲醇对样品进行洗脱，加无水甲醇后，开始用试管接收样品，并用高纯氮气 吹干。 6) 往试管中加 1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和 1 mL 0.2 mol/L 氢氧化钾 甲醇溶液，37℃，水浴 15 min。 7) 再加 0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和 2 mL 灭菌去离子水， 振荡分离，静置 1 h 分层。 8) 将上层小心转移至另一试管中，高纯氮气吹干， 9) 加入 2 mL 含 33 μg/mL 内标十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester） 的有机溶剂正己烷，用注射器经有机相滤膜过滤后注入样品瓶，上机待测。 方法二： 1) 取 5 g（称准至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。 2) 将上清转移至新的用锡箔纸包裹的离心管中，加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠 檬酸缓冲液，混匀，4℃静置过夜； 3) 4000 r/min 离心 10 min，收集下层溶液，合并两次的下层溶液； 4) 剩下步骤同方法一 3）~9） 方法三： 1) 取 5 g（称准至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mLBligh-Dyer 提取 液，离心管用锡纸包裹，250 r/min 振荡提取 2 h； 2) 2000 r/min 离心 10 min，上清转移至以新的用锡箔纸包裹的离心管中。下层 固体在加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液 250 r/min 振荡提取 2 h，2500 r/min 离心 10 min，取上清，合并上清溶液； 3) 向上清溶液加入 5 mL 氯仿，5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜； 4) 剩下步骤同方法一中 3）~9） 1.3.2 样品水分和堆积样品取样温度的测定 样品水分含量的测定按照沈怡方 [78] 的方法，计算样品的绝对干重。堆积样品 取样点温度的测定：每次取样前先用温度计插入取样点，待读数稳定后读数，并 计算 3 个取样点的平均温度。 1.3.3 PLFA 的 GC-MS 检测 提取各样品的 PLFA 后，用 Agilent 6890N 气-质联用仪测定样品 PLFA 的含 量。 1.3.3.1 色谱条件 色谱柱： HP-5MS (30. 0 m ×250 μm×0. 25 μm) 载气类型：高纯氮气 流速： 1.5 mL/min 进样量：1 μL 分流比：10:1 升温程序：初始温度 50℃维持 1 min,分 4 个阶段程序性升温: 50～180℃, 12 ℃/min,保持 2 min; 180～220 ℃, 6 ℃/min,保持 2 min; 220～240 ℃, 15 ℃ /min,保持 1 min; 240～260 ℃, 15 ℃/min,保持 15 min。 1.3.3.2 质谱条件 连接口温度：250℃ 电离方式：EI 电子能量：70 eV 离子源温度：200℃ 我用的是方法一效果不错哦 |
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