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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助】微生物磷脂脂肪酸测定分析方法（PLFA）
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Latte_ppp

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】微生物磷脂脂肪酸测定分析方法（PLFA）

急求微生物磷脂脂肪酸（PLFA）测定分析方法的具体步骤

刚步入研究生活，各方面搜集资料的能力还有限，要开题了，比较头大。
现在需要确定实验计划了，要测PLFA。上网查了，发现各实验方法都有不一样的地方，现想寻求一种已实验过的较成熟方法。
谢谢各位学术哥哥姐姐了~~
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1楼2012-10-23 10:52:51
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Latte_ppp

新虫 (初入文坛)
ps：纯培养微生物的提取~
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2楼2012-10-23 15:24:37
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Latte_ppp

新虫 (初入文坛)
木有人理  自己顶一个！
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3楼2012-11-05 17:01:19
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shouhuweilai

木虫 (著名写手)
关注中....
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佛曰：人生在世如身处荆棘之中，心不动，人不妄动，不动则不伤；如心动则人妄动， 伤其身痛其骨，于是体会到世间诸般痛苦！
4楼2012-11-05 17:25:31
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Latte_ppp

新虫 (初入文坛)
5楼2012-11-29 18:55:24
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xujin0525

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

方法一：
1) 取 5 g（精确至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取
液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜。
3) 4000 r/min 室温离心 10 min，用无菌一次性吸管小心吸掉上清液，下层用滤
纸过滤至锡纸包裹的小三角瓶中，高纯氮气吹干。
4) 用氯仿冲洗小柱，将活化后的硅胶（事先在 105℃烘干 1h，冷却至室温）加
一定量的氯仿浸泡，用胶头吸管吸入柱中，注意滴加过程要缓慢，不要产生
气泡，并保持柱子液面水平，上层氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸，
底部连接橡皮管，并用夹子旋紧静置 1~2h。
5) 待柱子稳定后再用氯仿小心重洗柱子，在样品三角瓶中加 300 μL 氯仿溶解样
品，用吸管转移至柱中，分别用 10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 无水
甲醇对样品进行洗脱，加无水甲醇后，开始用试管接收样品，并用高纯氮气
吹干。
6) 往试管中加 1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和 1 mL 0.2 mol/L 氢氧化钾
甲醇溶液，37℃，水浴 15 min。
7) 再加 0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和 2 mL 灭菌去离子水，
振荡分离，静置 1 h 分层。
8) 将上层小心转移至另一试管中，高纯氮气吹干，
9) 加入 2 mL 含 33 μg/mL 内标十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester）
的有机溶剂正己烷，用注射器经有机相滤膜过滤后注入样品瓶，上机待测。
方法二：
1) 取 5 g（称准至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取
液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。

2) 将上清转移至新的用锡箔纸包裹的离心管中，加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠
檬酸缓冲液，混匀，4℃静置过夜；
3) 4000 r/min 离心 10 min，收集下层溶液，合并两次的下层溶液；
4) 剩下步骤同方法一 3）~9）
方法三：
1) 取 5 g（称准至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mLBligh-Dyer 提取
液，离心管用锡纸包裹，250 r/min 振荡提取 2 h；
2) 2000 r/min 离心 10 min，上清转移至以新的用锡箔纸包裹的离心管中。下层
固体在加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液 250 r/min 振荡提取 2 h，2500
r/min 离心 10 min，取上清，合并上清溶液；
3) 向上清溶液加入 5 mL 氯仿，5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜；
4) 剩下步骤同方法一中 3）~9）
1.3.2 样品水分和堆积样品取样温度的测定
样品水分含量的测定按照沈怡方
[78]
的方法，计算样品的绝对干重。堆积样品
取样点温度的测定：每次取样前先用温度计插入取样点，待读数稳定后读数，并
计算 3 个取样点的平均温度。
1.3.3 PLFA 的 GC-MS 检测
提取各样品的 PLFA 后，用 Agilent 6890N 气-质联用仪测定样品 PLFA 的含
量。
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱： HP-5MS (30. 0 m ×250 μm×0. 25 μm)
载气类型：高纯氮气
流速： 1.5 mL/min
进样量：1 μL
分流比：10:1
升温程序：初始温度 50℃维持 1 min,分 4 个阶段程序性升温: 50～180℃,
12 ℃/min,保持 2 min; 180～220 ℃, 6 ℃/min,保持 2 min; 220～240 ℃, 15 ℃
/min,保持 1 min; 240～260 ℃, 15 ℃/min,保持 15 min。
1.3.3.2 质谱条件
连接口温度：250℃
电离方式：EI
电子能量：70 eV
离子源温度：200℃


我用的是方法一效果不错哦
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6楼2013-07-29 21:02:46
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15834741652

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xujin0525 at 2013-07-29 21:02:46
方法一：
1) 取 5 g（精确至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取
液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4 ...

想问一下，脂肪酸的丰度怎么计算？
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我们要相信科学
7楼2014-11-28 19:44:41
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cynlicious

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xujin0525 at 2013-07-29 21:02:46
方法一：
1) 取 5 g（精确至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取
液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4 ...

您好。我最近刚做了PLFA。现在有个问题想请教一下：PLFA的命名是命磷脂脂肪酸呢还是甲酯化后得到的磷脂脂肪酸甲酯？
PS:我用的sigma的37种混标
不胜感激
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气顺，心顺，事顺。不要有功利心，耶！
8楼2015-09-10 20:41:46
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Moonyleeeee

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xujin0525 at 2013-07-29 21:02:46
方法一：
1) 取 5 g（精确至 0.01 g）大曲样品于 50 mL 离心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取
液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4 ...

你好，研一小白一枚，最近老板把提取磷脂脂肪酸的活交给了我，可惜第一次做这种实验，看了相关文献大致确定了实验方案，可其中有的实验步骤不是很懂。提取磷脂脂肪酸的时候为什么一定要用氮气吹干呀？还有关于SPE柱的问题，SPE柱是否可以重复利用，如果可以重复利用，一根柱子每次加入不同量的样品，每次用过之后是否得进行冲洗？还有SPE柱的具体使用方法是什么样的，看的文献里说的都比较笼统。麻烦大神了
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9楼2017-11-08 19:57:02
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