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973762089

铁虫 (初入文坛)

[求助] 3‘RACE电泳图跑成这样是怎么回事，求高手们指点一下，迷茫 已有1人参与

我用的是巢式PCR法做的RACE，两次结果，产物都积在胶孔处，求教做过3’RACE的朋友们这是怎么回事呢，很迷茫，做不出来。
前4个是第三次PCR结果，后两个是第二轮PCR结果。
4)PCR反应程序如下
第一次PCR：
cDNA                        2 μL
10×PCR buffer          2 .5μL
Ex Taq HS                0.2 μL
dNTP （10 mmol·L-1）        0.3 μL
GSP-F1                          0.5 μL
M13 Primer M4                  0.5 μL
超纯H2O                          18.1 μL
总体积                          25 μL
反应条件为： 95℃ 5min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 1min，3 个循环；95℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min，3 个循环；95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 1min，3 个循环；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，3 个循环；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25 个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
第二轮和第三轮PCR反应分别以上一轮PCR反应的产物为底物，未稀释，程序、体系一样。

3‘RACE电泳图跑成这样是怎么回事，求高手们指点一下，迷茫
IMG_20141120_112123.jpg
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1楼 2014-11-20 20:21:28
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973762089

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2014-11-21 13:45:00
这种情况没有遇到过。1 第一轮PCR的cDNA模板浓度和质量怎么样，建议将模板浓度控制到所用聚合酶的适用范围，大部分是50-100ng；2 PCR产物作模板时，我一般先将PCR产物纯化，再稀释到合适的浓度。
建议浅薄，多联系

明白了，谢谢！
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3楼2014-11-21 14:22:31
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昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种情况没有遇到过。1 第一轮PCR的cDNA模板浓度和质量怎么样，建议将模板浓度控制到所用聚合酶的适用范围，大部分是50-100ng；2 PCR产物作模板时，我一般先将PCR产物纯化，再稀释到合适的浓度。
建议浅薄，多联系
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太阳出来，星星要走。
2楼2014-11-21 13:45:00
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