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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

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急速潜航~
11楼2014-11-18 21:54:19
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古韵清音

银虫 (小有名气)

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引物在ncbi里blast过吗?我曾经有个pcr用高保真的酶做不出,换rtaq就出来了。有些问题真的很难说的。不过一般半定量的实验只要基因有表达很容易扩的
12楼2014-11-18 23:30:08
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

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排除引物和模板问题,建议更换试剂。一般的PCR Mix较为有用。

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日拱一卒,功不唐捐
13楼2014-11-19 07:10:29
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劳龙宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 古韵清音 at 2014-11-18 23:30:08
引物在ncbi里blast过吗?我曾经有个pcr用高保真的酶做不出,换rtaq就出来了。有些问题真的很难说的。不过一般半定量的实验只要基因有表达很容易扩的

引物是genetool设计的,但是得分不是很高!我blast过了!rtaq和Extaq有什么不一样吗?如果半定量扩不出来是不是就意味着这个基因没有表达啊?
14楼2014-11-19 08:42:34
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劳龙宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 劳龙宝 at 2014-11-18 20:40:23
cDNA稀释是因为我要做半定量,是说退火温度要比合成单上面的低5°吧!,我今天也在想这个基因到底在我取得材料里面有表达吗?后来我和别人讨论了,应该有表达了的,只是表达量的问题!酶的话我刚开始都是用的新的! ...

刚才又做了个温度梯度(52~63°,引物合成单上给出的Tm数值是57.3和59.3),是用没有稀释的cDNA作为模板P的,出现了目的条带,不过是我做半定量的目的条带!在500~750之间!大约是600多!我只用了28个循环,有引物二聚体,目的条带不是很亮!请问我该怎么优化体系呢?给点建议吧!谢谢
15楼2014-11-19 15:11:23
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a50044758

银虫 (小有名气)

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模板有问题,换模板吧,我们实验室有个同学就是这样,模板的质量不行。
16楼2014-11-19 15:48:37
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劳龙宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by a50044758 at 2014-11-19 15:48:37
模板有问题,换模板吧,我们实验室有个同学就是这样,模板的质量不行。

今天确实是换了之前分装的cDNA(反转后没有用过的),做个温度梯度就出现了目的条带!但是带比较淡!现在就是如何使目的条带亮点!谢谢!
17楼2014-11-19 15:56:46
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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

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引用回帖:
14楼: Originally posted by 劳龙宝 at 2014-11-19 08:42:34
引物是genetool设计的,但是得分不是很高!我blast过了!rtaq和Extaq有什么不一样吗?如果半定量扩不出来是不是就意味着这个基因没有表达啊?...

extaq有校正的功能。稍长的片段,会一直校对,切切切,扩不出来。

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急速潜航~
18楼2014-11-19 15:57:15
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happydove

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:35
1是用内参做个对照
2是用普通的酶就可以
3是如果是表达量比较低 模板量多加  先不稀释试一下
4退火温度50度先扩一下看看吧
19楼2014-11-19 17:30:31
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happydove

新虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:47
有非特异条带就提高退火温度  模板量多加点 试试
20楼2014-11-19 17:31:49
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