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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 750bp片段克隆
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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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急速潜航~
11楼2014-11-18 21:54:19
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古韵清音

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:08
引物在ncbi里blast过吗？我曾经有个pcr用高保真的酶做不出，换rtaq就出来了。有些问题真的很难说的。不过一般半定量的实验只要基因有表达很容易扩的
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12楼2014-11-18 23:30:08
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)

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排除引物和模板问题，建议更换试剂。一般的PCR Mix较为有用。

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日拱一卒，功不唐捐
13楼2014-11-19 07:10:29
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 古韵清音 at 2014-11-18 23:30:08
引物在ncbi里blast过吗？我曾经有个pcr用高保真的酶做不出，换rtaq就出来了。有些问题真的很难说的。不过一般半定量的实验只要基因有表达很容易扩的

引物是genetool设计的，但是得分不是很高！我blast过了！rtaq和Extaq有什么不一样吗？如果半定量扩不出来是不是就意味着这个基因没有表达啊？
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14楼2014-11-19 08:42:34
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 劳龙宝 at 2014-11-18 20:40:23
cDNA稀释是因为我要做半定量，是说退火温度要比合成单上面的低5°吧！，我今天也在想这个基因到底在我取得材料里面有表达吗？后来我和别人讨论了，应该有表达了的，只是表达量的问题！酶的话我刚开始都是用的新的！ ...

刚才又做了个温度梯度（52~63°，引物合成单上给出的Tm数值是57.3和59.3），是用没有稀释的cDNA作为模板P的，出现了目的条带，不过是我做半定量的目的条带！在500~750之间！大约是600多！我只用了28个循环，有引物二聚体，目的条带不是很亮！请问我该怎么优化体系呢？给点建议吧！谢谢
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15楼2014-11-19 15:11:23
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a50044758

银虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:25
模板有问题，换模板吧，我们实验室有个同学就是这样，模板的质量不行。
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16楼2014-11-19 15:48:37
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by a50044758 at 2014-11-19 15:48:37
模板有问题，换模板吧，我们实验室有个同学就是这样，模板的质量不行。

今天确实是换了之前分装的cDNA(反转后没有用过的)，做个温度梯度就出现了目的条带！但是带比较淡！现在就是如何使目的条带亮点！谢谢！
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17楼2014-11-19 15:56:46
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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

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引用回帖:
14楼: Originally posted by 劳龙宝 at 2014-11-19 08:42:34
引物是genetool设计的，但是得分不是很高！我blast过了！rtaq和Extaq有什么不一样吗？如果半定量扩不出来是不是就意味着这个基因没有表达啊？...

extaq有校正的功能。稍长的片段，会一直校对，切切切，扩不出来。

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急速潜航~
18楼2014-11-19 15:57:15
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happydove

新虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:35
1是用内参做个对照
2是用普通的酶就可以
3是如果是表达量比较低 模板量多加  先不稀释试一下
4退火温度50度先扩一下看看吧
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19楼2014-11-19 17:30:31
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happydove

新虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 18:34:47
有非特异条带就提高退火温度  模板量多加点 试试
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20楼2014-11-19 17:31:49
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