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xiaoqin813

金虫 (初入文坛)

[交流] 求助:关于转化的问题

我的实验是将不超过1kb的片断连入pGBKT7载体,
1.先对pGBKT7空质粒和1kb的片断进行双酶切,切完之后质粒变成一条带,那说明质粒应该是线性的。
2.pGBKT7质粒与1kb的片断酶连,在4度酶连过夜或是16度2小时都做过
3.然后进行转化,结果有几次都没有菌落生长出来。最近长出来几个菌落,提质粒之后进行双酶切,没有连进去的片断,只有一条与pGBKT7质粒大小相当的带(之前菌落PCR扩出来一个大小不会的片断)。
请各位帮忙看一些我的实验可能那里有问题啊?
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weiwei1

木虫 (小有名气)

质粒酶切后,大小正确吗;
感受态的问题;
目的片段和载体片段,连接时的量;
连接后单酶切就可以判断是否连接正确了,双酶切的话,目的片段太小,可能要比载体片段暗,会不会没看见;
酶切胶回收后,是否回收到载体和目的片段
7楼2008-05-15 16:05:51
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seahow

木虫 (著名写手)

说说你的酶切位点
2楼2008-05-12 17:12:33
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草菡

铁虫 (初入文坛)

建议

你的酶切位点和你的片段是不是吻合?
爱自己相爱的人。
3楼2008-05-12 17:36:22
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26633369

金虫 (小有名气)

★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):有条有理,还有自己的经验,呵呵,值得鼓励。
1.你先验证一下你的目的片段是否正确
2.检查一下设计引物的酶切位点、目的片段和载体的酶切位点是否吻合
3.有可能是你的酶过期了,又一次我做实验怎么都找不出问题,最后无意发现是酶过期了,让人很生气
4.如果还是做不出来,只能反复做,总有一次能出来,失败是成功的妈妈!我们做实验的人都会经历这样的过程!
5楼2008-05-15 09:51:16
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