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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于转化的问题
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xiaoqin813

金虫 (初入文坛)

[交流] 求助：关于转化的问题

我的实验是将不超过1kb的片断连入pGBKT7载体，
1.先对pGBKT7空质粒和1kb的片断进行双酶切，切完之后质粒变成一条带，那说明质粒应该是线性的。
2.pGBKT7质粒与1kb的片断酶连，在4度酶连过夜或是16度2小时都做过
3.然后进行转化，结果有几次都没有菌落生长出来。最近长出来几个菌落，提质粒之后进行双酶切，没有连进去的片断，只有一条与pGBKT7质粒大小相当的带（之前菌落PCR扩出来一个大小不会的片断）。
请各位帮忙看一些我的实验可能那里有问题啊？
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1楼 2008-05-12 16:30:16
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seahow

木虫 (著名写手)
说说你的酶切位点
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2楼2008-05-12 17:12:33
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草菡

铁虫 (初入文坛)

建议

你的酶切位点和你的片段是不是吻合？
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爱自己相爱的人。
3楼2008-05-12 17:36:22
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amilie030312

金虫 (正式写手)
你切的不对吧
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4楼2008-05-14 15:21:58
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26633369

金虫 (小有名气)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):有条有理，还有自己的经验，呵呵，值得鼓励。
1.你先验证一下你的目的片段是否正确
2.检查一下设计引物的酶切位点、目的片段和载体的酶切位点是否吻合
3.有可能是你的酶过期了，又一次我做实验怎么都找不出问题，最后无意发现是酶过期了，让人很生气
4.如果还是做不出来，只能反复做，总有一次能出来，失败是成功的妈妈！我们做实验的人都会经历这样的过程！
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5楼2008-05-15 09:51:16
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allen8368

木虫 (正式写手)
既然是双酶切 切出来的怎么会是一条带呢？
标准的应该是三条带  
没切的一条  大片段一条 还有小片段一条  楼主再看看吧
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慢慢的认识你，再慢慢的忘记你...........
6楼2008-05-15 11:06:58
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weiwei1

木虫 (小有名气)
质粒酶切后,大小正确吗；
感受态的问题；
目的片段和载体片段，连接时的量；
连接后单酶切就可以判断是否连接正确了，双酶切的话，目的片段太小，可能要比载体片段暗，会不会没看见；
酶切胶回收后，是否回收到载体和目的片段
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7楼2008-05-15 16:05:51
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