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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】质粒提不出来
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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】质粒提不出来

我最近打算做PC扩增目的基因，引物都来了，却发现目的基因提不出来了，老板还催着，着急啊。

我的目的基因所用的载体是invitrogen的pcDNA3.1/ZEO(+)，其上面用的Ori是PUC origin ,我看文献上说这种复制子拷贝数能到100多，但是除了第一次转化完了，用保存完菌种剩下的提出来了一次，以后提了三次除了RNA什么都没有。

我问老师他说可能是抗生素失效了，于是我就用无抗性的DH5Α做了一次抗生素对照,结果什么都没长，抗生素没问题，我实在想不出别的原因了，还不好意思去问老师，还请各位虫友给以指点，不胜感激。

载体图谱：
（附件中也有）
http://tools.invitrogen.com/cont ... pcdna3.1zeo_map.pdf
[search]质粒，拷贝数[/search]
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1楼 2008-04-30 21:19:29
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mimisikai

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
humants(金币+2,VIP+0):谢谢...我试一下
humants(金币+1,VIP+0):谢谢....我挑单菌落后提出来了,但不知道具体原因.
前段时间我也遇到相似问题，就是质粒咋都没有或者提出来了酶切也能“一剪梅”
我觉得是质粒问题，或者是质粒菌问题。可以先活化，挑单克隆，一个个试吧。对于这种找不到原因的问题，真的没办法。
顺便说一句，重新配试剂，用新tip 所有的东西能灭菌的都要灭
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6楼2008-05-01 16:58:08
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humants

金虫 (正式写手)
对了，再补充一句，我的发酵时间是12个小时
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2楼2008-04-30 21:20:35
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pph0259

木虫 (正式写手)
★ ★
humants(金币+2,VIP+0):谢谢，师姐..呵呵..不知道可不可以，再提不出来我就直接做菌落PCR。
你如果是打算从载体上扩增目的片段，那么可以直接做菌落PCR;
不需要提质粒。
另外，你提不出质粒是很奇怪的，因为提质粒是最最常规基础的操作，
你严格按分子克隆手册的方法提就可以了。
建议你关注你的试剂是否有问题。
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3楼2008-04-30 23:42:23
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
试剂是否有问题?
Minipore是否有问题?
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
4楼2008-05-01 11:17:47
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