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humants

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】质粒提不出来

我最近打算做PC扩增目的基因,引物都来了,却发现目的基因提不出来了,老板还催着,着急啊。

我的目的基因所用的载体是invitrogen的pcDNA3.1/ZEO(+),其上面用的Ori是PUC origin ,我看文献上说这种复制子拷贝数能到100多,但是除了第一次转化完了,用保存完菌种剩下的提出来了一次,以后提了三次除了RNA什么都没有。

我问老师他说可能是抗生素失效了,于是我就用无抗性的DH5Α做了一次抗生素对照,结果什么都没长,抗生素没问题,我实在想不出别的原因了,还不好意思去问老师,还请各位虫友给以指点,不胜感激。

载体图谱:
(附件中也有)
http://tools.invitrogen.com/cont ... pcdna3.1zeo_map.pdf
[search]质粒,拷贝数[/search]
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li_shengjun

银虫 (初入文坛)

重配试剂或者用别人的试试看,这么简单的试验一般是不会出操作问题的。
5楼2008-05-01 16:29:56
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查看全部 7 个回答

humants

金虫 (正式写手)

对了,再补充一句,我的发酵时间是12个小时
2楼2008-04-30 21:20:35
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pph0259

木虫 (正式写手)

★ ★
humants(金币+2,VIP+0):谢谢,师姐..呵呵..不知道可不可以,再提不出来我就直接做菌落PCR。
你如果是打算从载体上扩增目的片段,那么可以直接做菌落PCR;
不需要提质粒。
另外,你提不出质粒是很奇怪的,因为提质粒是最最常规基础的操作,
你严格按分子克隆手册的方法提就可以了。
建议你关注你的试剂是否有问题。
3楼2008-04-30 23:42:23
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

试剂是否有问题?
Minipore是否有问题?
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
4楼2008-05-01 11:17:47
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