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hongkaichen金虫 (小有名气)
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[交流]
求助！关于PCR的。
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我想问下P出这样的图是由什么原因引起的，老P不出来，我的加样情况是：DNA 1ul ,引物 1ul ，mgcl2 3ul,buffer 5ul,tag 0.5ul. 设置程序是： 94 5-10min 94 1 min 50-54 1-2min 72 1-2min cycle 30 72 5min 8 保存 做了好多次，上面的1-2，是指有1min和2min都做过，50度到54度也做过，开始还P出来过一点好淡的带，现在一点都没了，请各位给予指教！ |
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参考意见
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首先，上面那块胶是否有加marker?如果加了marker，但是现在看来连marker都没有，这么说可能就是电泳的问题。下方那块小胶，左边的是Marker吗? 如果是的话，marker就没有跑好，电泳的效果就不好，所以首先要确定是否是电泳操作的问题。电泳缓冲液、制胶和电压等操作细节务必注意。 请问“退火温度50-54 1-2min”，具体如何调整这个范围的？请问这个退火温度是如何确定的，能给出你的引物序列吗？以及产物片段多少bp? 下图有非特意扩增条带，我曾经试过退火温度不适合，就出现了以上情况，退火温度的选择应根据文献报道，如果是自己设计的引物，就从比引物的Tm值低5度开始试验，每次提高2度，然后根据条带结果再细致调整。 上面一幅图，呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带呈不清晰的成片条带，一般可能是引物浓度不合适和Mg2+浓度不合适，造成无效延伸。你只给出了加入MgCl2的体积，但是总的反应体积是？Mg2＋的浓度是很重要的。通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平 只是我自己的一点经验，有不足之处还希望指正^_^ |
2楼2008-04-29 17:18:19
3楼2008-04-29 17:55:03
xiaoli8609
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hongkaichen
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6楼2008-04-30 08:45:08