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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助转化

各位达人,转化做了好几次了,老是失败,很是郁闷,请大家指教!我的程序是将连接产物直接转化到BL21感受态中,然后涂amp板挑阳性菌落,小摇一下后做菌液PCR验证,发现PCR结果很奇怪,有部分pcr在目的条带1.5Kbp处出现一片模糊,抽质粒也没结果,大家看看我的PCR图吧
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clf0803

银虫 (正式写手)

大家帮忙分析分析吧
2楼2008-04-28 19:48:46
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张力民

铜虫 (小有名气)

你转化的是连接产物还是构建好的质粒?
3楼2008-04-28 20:08:15
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clf0803

银虫 (正式写手)

连接产物转化到BL21感受态
4楼2008-04-28 20:12:14
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张力民

铜虫 (小有名气)

连接产物建议换一下感受态如DH5α JM109
5楼2008-04-28 20:36:35
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pph0259

木虫 (正式写手)

就是没连上,
重新做连接,
转化一般不会出问题,除非菌种出毛病,那是超小概率事件
6楼2008-04-28 22:49:36
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weiwei1

木虫 (小有名气)

连接后先转化DH5a,测序等鉴定正确后再转化DE3。尽量不用菌落PCR,抽提后的效果更好。
7楼2008-04-29 10:55:19
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playboy723

金虫 (正式写手)

恩  先转到克隆菌内,如DH5a,JM109和TOP10等   鉴定正确后再转到表达菌里如BL21   两种菌的作用是不同的
8楼2008-04-29 10:58:34
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clf0803

银虫 (正式写手)

还有,我的酶切位点分别是NdeI和HindIII,听说NdeI很难切,我分别单酶切12h,连接也是12h,这还有问题吗?连接体系是2微升质粒,6微升DNA,1微升连接酶,1微升buffer。

再有,如果没有连上目的基因的话那Amp板上长出的菌落应该是载体自连的,那为什么抽不到质粒呢?

大家处处主意,先谢过了!

[ Last edited by clf0803 on 2008-4-30 at 09:09 ]
9楼2008-04-30 09:03:07
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