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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助转化

各位达人，转化做了好几次了，老是失败，很是郁闷，请大家指教！我的程序是将连接产物直接转化到BL21感受态中，然后涂amp板挑阳性菌落，小摇一下后做菌液PCR验证，发现PCR结果很奇怪，有部分pcr在目的条带1.5Kbp处出现一片模糊，抽质粒也没结果，大家看看我的PCR图吧
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1楼 2008-04-28 19:47:17
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clf0803

银虫 (正式写手)
大家帮忙分析分析吧
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2楼2008-04-28 19:48:46
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张力民

铜虫 (小有名气)
你转化的是连接产物还是构建好的质粒？
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3楼2008-04-28 20:08:15
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clf0803

银虫 (正式写手)
连接产物转化到BL21感受态
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4楼2008-04-28 20:12:14
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张力民

铜虫 (小有名气)
连接产物建议换一下感受态如DH5α JM109
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5楼2008-04-28 20:36:35
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pph0259

木虫 (正式写手)
就是没连上，
重新做连接，
转化一般不会出问题，除非菌种出毛病，那是超小概率事件
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6楼2008-04-28 22:49:36
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weiwei1

木虫 (小有名气)
连接后先转化DH5a,测序等鉴定正确后再转化DE3。尽量不用菌落PCR,抽提后的效果更好。
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7楼2008-04-29 10:55:19
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playboy723

金虫 (正式写手)
恩  先转到克隆菌内，如DH5a,JM109和TOP10等   鉴定正确后再转到表达菌里如BL21   两种菌的作用是不同的
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8楼2008-04-29 10:58:34
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clf0803

银虫 (正式写手)
还有，我的酶切位点分别是NdeI和HindIII，听说NdeI很难切，我分别单酶切12h，连接也是12h，这还有问题吗？连接体系是2微升质粒，6微升DNA，1微升连接酶，1微升buffer。

再有，如果没有连上目的基因的话那Amp板上长出的菌落应该是载体自连的，那为什么抽不到质粒呢？

大家处处主意，先谢过了！

[ Last edited by clf0803 on 2008-4-30 at 09:09 ]
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9楼2008-04-30 09:03:07
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