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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR求助
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)

[交流] PCR求助

我现在需要PCR 4kb 的片段，模板是基因组DNA，以前没做过这么长的，PCR两次了都没出来，请问，做这样的反应需要注意什么，请给点经验，谢谢了，急！！！
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1楼 2008-04-28 08:41:31
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biogefart

木虫 (著名写手)

贴上你的条件看看

不然怎么提意见？
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闹太套
2楼2008-04-28 08:44:08
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)
谢谢楼上，
体系是premix tag 12.5ul
         primer 1:    1ul
         primer 2：  1ul
         template： 1ul
         water:       9.5ul

cycle:
         95        5min
         95        1min
         42         1min     30cycles
          72        4min
          72        10min



还请帮帮忙
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3楼2008-04-28 08:52:45
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
你的退火温度是经过PCR梯度试验得到的吗？
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
4楼2008-04-28 09:00:45
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biogefart

木虫 (著名写手)

看错了，

延伸时间应该还好，先分析一下你的模板吧（GC含量，特殊结构？） ，可能会对你有帮助，
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闹太套
5楼2008-04-28 09:10:08
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七月的苹果

铜虫 (小有名气)
调节一下温度试试
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6楼2008-04-28 10:05:59
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神仙糊涂

我觉得是不是变性时间1分钟有些短啊，我现在也在做PCR，我的目标片段是1.5KB，变性时间100S,你参考一下
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7楼2008-04-28 15:38:11
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humants

金虫 (正式写手)
支持楼上的观点，可能是你的单链模板就没得到，因为你的目的基因太长，如果不行呢你可以在目的基因的中间再找一对引物，做巢式PCR！
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8楼2008-04-28 18:50:02
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
看看自己的ＣＤＮＡ模板效果怎么样先．
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9楼2008-04-28 18:51:39
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)
同意大家的观点，我又做了一次，1分30秒，有结果告诉大家，谢谢大家，欢迎大家继续提意见，还有我会申请给大家加分
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10楼2008-04-28 20:10:44
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