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yaoyaochong

银虫 (正式写手)

[交流] PCR求助

我现在需要PCR 4kb 的片段,模板是基因组DNA,以前没做过这么长的,PCR两次了都没出来,请问,做这样的反应需要注意什么,请给点经验,谢谢了,急!!!
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biogefart

木虫 (著名写手)

贴上你的条件看看

不然怎么提意见?
闹太套
2楼2008-04-28 08:44:08
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)

谢谢楼上,
体系是premix tag 12.5ul
         primer 1:    1ul
         primer 2:  1ul
         template: 1ul
         water:       9.5ul

cycle:
         95        5min
         95        1min
         42         1min     30cycles
          72        4min
          72        10min



还请帮帮忙
3楼2008-04-28 08:52:45
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

你的退火温度是经过PCR梯度试验得到的吗?
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索
4楼2008-04-28 09:00:45
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biogefart

木虫 (著名写手)

看错了,

延伸时间应该还好,先分析一下你的模板吧(GC含量,特殊结构?) ,可能会对你有帮助,
闹太套
5楼2008-04-28 09:10:08
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七月的苹果

铜虫 (小有名气)

调节一下温度试试
6楼2008-04-28 10:05:59
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神仙糊涂

我觉得是不是变性时间1分钟有些短啊,我现在也在做PCR,我的目标片段是1.5KB,变性时间100S,你参考一下
7楼2008-04-28 15:38:11
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humants

金虫 (正式写手)

支持楼上的观点,可能是你的单链模板就没得到,因为你的目的基因太长,如果不行呢你可以在目的基因的中间再找一对引物,做巢式PCR!
8楼2008-04-28 18:50:02
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

看看自己的CDNA模板效果怎么样先.
9楼2008-04-28 18:51:39
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yaoyaochong

银虫 (正式写手)

同意大家的观点,我又做了一次,1分30秒,有结果告诉大家,谢谢大家,欢迎大家继续提意见,还有我会申请给大家加分
10楼2008-04-28 20:10:44
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