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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于连接的问题
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playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 关于连接的问题

各位高手：
请教一个问题，我要做一个连接  用的是双酶切   EcoR1  和Xho1  10微升体系，  好像Xho1连接较困难（需用平端连的条件）   于是我就改变了一下连接体系T4 buffer  1
   T4 ligase   0.75
    ATP     1
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1楼 2008-04-24 11:59:10
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playboy723

金虫 (正式写手)
各位高手：
请教一个问题，我要做一个连接  用的是双酶切   EcoR1  和Xho1  10微升体系，  好像Xho1连接较困难（需用平端连的条件）   于是我就改变了一下连接体系
T4 buffer  1
   T4 ligase   0.75
    ATP     1
   载体和PCR产物片段  7.25（比例约为1：3－10）
然后28 度2.5小时   
结果转化后没有菌落  
我想请教一下 我的体系合适吗  应该怎样改进一下
另外是否必须得16度过夜吗   我28度2小时可以吗  我现在搞不清楚到底是哪里出错了   求教     希望大家不吝赐教
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2楼2008-04-24 12:02:53
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sevenlight967

银虫 (小有名气)
自连产物都没有？
你的感受态好用不？
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3楼2008-04-24 12:18:12
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playboy723

金虫 (正式写手)
自连有用吗  如果有自连的话就会有克隆了
感受态好使   确信
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4楼2008-04-24 13:26:04
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fairytale527

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):积极交流奖
我也是用双酶切   EcoR1  和Xho1
连接25度3小时
效果就很好啊，也不会有自连产物的呀。
用连接酶和buffer,没有加过ATP哦。我用的是天根公司的连接酶和buffer
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5楼2008-04-24 14:43:31
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):积极交流奖
16度过夜连接试试吧
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6楼2008-04-24 15:00:32
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ypan

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
连接反应一般不需要加ATP，可以加点BSA！
连接可以在4度冰箱反应最少16小时！
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7楼2008-04-24 15:49:45
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playboy723

金虫 (正式写手)
谢谢高手  呵呵  领教了   
大家还有其他的好建议吗
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8楼2008-04-24 19:14:21
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