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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] 关于连接的问题

各位高手:
请教一个问题,我要做一个连接  用的是双酶切   EcoR1  和Xho1  10微升体系,  好像Xho1连接较困难(需用平端连的条件)   于是我就改变了一下连接体系T4 buffer  1
   T4 ligase   0.75
    ATP     1
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playboy723

金虫 (正式写手)

各位高手:
请教一个问题,我要做一个连接  用的是双酶切   EcoR1  和Xho1  10微升体系,  好像Xho1连接较困难(需用平端连的条件)   于是我就改变了一下连接体系
T4 buffer  1
   T4 ligase   0.75
    ATP     1
   载体和PCR产物片段  7.25(比例约为1:3-10)
然后28 度2.5小时   
结果转化后没有菌落  
我想请教一下 我的体系合适吗  应该怎样改进一下
另外是否必须得16度过夜吗   我28度2小时可以吗  我现在搞不清楚到底是哪里出错了   求教     希望大家不吝赐教
2楼2008-04-24 12:02:53
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sevenlight967

银虫 (小有名气)

自连产物都没有?
你的感受态好用不?
3楼2008-04-24 12:18:12
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playboy723

金虫 (正式写手)

自连有用吗  如果有自连的话就会有克隆了
感受态好使   确信
4楼2008-04-24 13:26:04
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fairytale527


reasonspare(金币+1,VIP+0):积极交流奖
我也是用双酶切   EcoR1  和Xho1
连接25度3小时
效果就很好啊,也不会有自连产物的呀。
用连接酶和buffer,没有加过ATP哦。我用的是天根公司的连接酶和buffer
5楼2008-04-24 14:43:31
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greenspringmi

银虫 (正式写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):积极交流奖
16度过夜连接试试吧
6楼2008-04-24 15:00:32
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ypan

木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
连接反应一般不需要加ATP,可以加点BSA!
连接可以在4度冰箱反应最少16小时!
7楼2008-04-24 15:49:45
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playboy723

金虫 (正式写手)

谢谢高手  呵呵  领教了   
大家还有其他的好建议吗
8楼2008-04-24 19:14:21
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