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[求助]
各位大哥大姐，希望你们能帮我分析分析
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各位大哥大姐，小弟现在寝食难安，做westernblot 遇到了个难题，请求你们的帮助。 小弟感觉蛋白时常会出现问题，好几次都是同一个样品前面两次做得齐了，后面就越来越不齐，呈毛毛虫样或者干脆就不出，蛋白即使加了4倍也有不出的。为什么会这样呢？好好的蛋白就怎么不行了? 小弟提取的蛋白是胰腺组织全蛋白，步骤如下： 1.取血后用镊子摘取胰腺组织。 2.胰腺组织入预冷PBS中，洗血后分若干部分，装入冰中。待全部取完放入-80冰箱。 3.取预冷的含pmsf 的碧云天裂解液400ul，插入冰中，取组织约60mg加入裂解液中。 4.电动匀浆器3档匀浆约20s，离心管一直插在冰中。 5.匀浆结束后冰中裂解30min，离心2000r/m，取上清超声5s*5s，再离心12000r/m，取上清。 6.测蛋白浓度，约半小时。 7.算体积，加入五成sds上样缓冲液，体积为蛋白量除4，沸水中变性7min中。分装成两份，一份-20，另一份-80冰箱保存。 小弟每次用细胞蛋白，都做的还可以，每个条带都出，细胞蛋白还是4个月前的。做细胞的抗体甚至是做组织蛋白白板回收的抗体。小弟现在懵了，组织蛋白到底是怎么了？谢谢各位了 |
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