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唐亦悠悠

金虫 (小有名气)

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[交流] 最近细胞受支原体污染，实验室在寻找解决办法

刚开始并没有在意，可是污染越来越严重，所有人的实验都进行不下去了，不得已，打算先甲醛和高锰酸钾熏蒸（用量：甲醛40%浓度加10ml /立方米，高锰酸钾5g/立方米），熏蒸完毕之后再将细胞加抗支原体药的培养基培养，抗支原体药还没决定买哪家的。
大家有什么好的建议，希望赐教。

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1楼 2014-09-21 11:08:21

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小刀188

金虫 (正式写手)

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★
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唐亦悠悠: 回帖置顶 2014-09-29 23:05:06

1、Q: 支原体污染对细胞有什么危害？

A: 支原体污染后，不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响 DNA 合成，抑制细胞生长等，以致影响实验数据的可信度。
2、Q: 支原体污染有什么特征？

A: 细胞状态变差,生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不发生浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。具体特征请见附件 2。
3、Q: 细胞培养时，显微镜下的小黑点是什么？
A: 支原体污染后，细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。

4、Q: 细胞通过何种途径感染支原体？

A: 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群如口腔中的支原体）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染等等，由于支原体大小为 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um），血清中也可能含有支原体。
5、Q: 支原体污染如何检测？

A: 利用支原体具特殊专一性之 primers，经由 PCR 反应来复制支原体 DNA。所用 primers 来自支原体的 conserved 16S-23S rRNA 序列，由于此段序列依支原体种类不同而不同，因此可依所复制之 DNA大小及其 restriction fragment 大小差异来作侦测与鉴定支原体。
（具体方法见附件）。
6、Q: 如何清除支原体？

A: 由于市场同类产品都为抗生素类，对细胞本身也会产生一定影响，而且有反复发作的风险，吉锐生物推出的 MycoplasmaOUT?Treatment，活性成分为抗菌肽，经多方测试表明对大部分细胞无毒害作用，因其独特的作用原理，支原体不会对其产生耐药性，并且其作用时间短，在三天内就可杀灭支原体，并自动降解成氨基酸，不会对细胞造成二次污染。
7、Q: 为什么在培养细胞前要加入MycoplasmaOUT? Prevention？
A：由于支原体污染后能够进入细胞，而MycoplasmaOUT? Prevention不能够进入细胞内也就不能杀灭已经进入细胞的支原体，而这部分细胞死亡时会释放其内部的支原体，需要MycoplasmaOUT?Prevention来杀灭新释放出的支原体，以防止新生细胞受到污染。

8、Q: 所谓的黑胶虫污染？
A:培养细胞发现小黑点现象很严重，原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻，认为那不过是自欺欺人的借口，觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了：细胞传代以后就出现细胞间黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。
上述现象很像所谓的“黑胶虫”。
我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫（现在看来是些胞外囊泡）的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染，间接表象是小黑点，被以讹传讹成为了“黑胶虫”。
光镜下看不到支原体，但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死，释放出大量碎片，看起来就像小黑虫子。
查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题；
说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清，而不是可以通过培养箱空气传播；感染最可能是牛源性的支原体，通过产道或血行感染。
所谓“细胞生长不受影响”，其实是污染的严重程度不高而已；
支原体污染严重就出现细胞大量空泡形成，细胞间空旷地带出现大量黑点，细胞最终凋亡、坏死，漂起来。有些国产血清写着建议灭活，其实是挂羊头卖狗肉，那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上还有很多杀不死的。但可以降低产品支原体等微生物污染风险。用阿奇霉素杀支原体，小黑点可以得到抑制，不过我想根治就很难了，而且处理时间很长，至少一个星期。
以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体，不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。