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wanlili122木虫 (正式写手)
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[交流]
帮帮我解决双酶切问题吧！我都快崩溃啦！
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我最近三个星期都在做转基因载体构建，双酶切载体和目标片段，再让它们连接，但是热激或者电转化以后长的单克隆摇菌后用我的特异引物扩增却不能扩出我要的片段，那么就是载体自连，但是载体是用双酶切切的怎么可能自连呢？一直不明白！ 我的酶切体系严格按照NEB说明书，用的都是NEB的酶，酶切质粒到是可以检测酶切完全了。但是我的目标片段酶切却很难检测是否酶切完全！ 我是对我的目标片段两端加保护碱基+酶切位点了的！ 连接过程： 载体2ul+目标片段6ul[保证二者摩尔比为1：3]在45度加热5分钟后置于冰上 加晶美10XT4Ligase Buffer 1ul T4Ligase 1U 5mMATP 1ul 16或22度1-4hours 转化大肠杆菌感受态【热激电转都做过】要么长的满皿都是斑要么很少斑，一挑检测全是假的，没有目标片段，抽过质粒检测酶切后本该一条带，但是结果是三条带而且没有和我的目标片段一样大小的带！怎么办啊？好郁闷啊！ 不知道是哪步出现问题啦？我想请教哪位大虾能把您的转基因载体构建的全过程详细地告知我？真是日夜期待啊！我的邮箱是wanlili122@yahoo.com.cn |
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xxh8372
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wanlili122
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8楼2008-04-22 19:58:53
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你好！ 我曾经做过分子克隆方面的实验，进行到目的片段与表达载体连接时也遇到过类似的情况，时间长达一个月之久。请教过很多老师和同学，都没得到正确的解决方法。于是尝试各种方法，重复做酶切-连接-电转-涂板-酶切及PCR验证，实验结果千奇百怪，不过我只能确定一点，就是没连上，但问题出在哪，我也不清楚。后来想了一个很笨的方法，就是从不同的阶段开始做重复试验，最后终于连接上。总结一下我的经验：1.目的基因片段太大，酶切不彻底。建议目的基因片段和表达载体的酶切体系应该适当扩大，比如酶切体系均为100μl，37度过夜后回收纯化，电泳检测看看回收效果再连接。2.可以将目的基因先克隆到T载体上，然后再从载体上切就很容易且可电泳检测；这样保证你的目的片段正确性。3.目的基因 4ul solution I 5 U 表达载体 1ul 16度12-16小时。 载体如果双酶切充分，应该自连的机会很小的。 4.感受态和电转时需要注意一些 我就知道这些，不知道对你是否有用，祝你早日解决问题，实验顺利  |
9楼2008-04-22 20:04:16
wanlili122
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10楼2008-04-23 08:27:04