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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 帮帮我解决双酶切问题吧！我都快崩溃啦！
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wanlili122

木虫 (正式写手)

[交流] 帮帮我解决双酶切问题吧！我都快崩溃啦！

我最近三个星期都在做转基因载体构建，双酶切载体和目标片段，再让它们连接，但是热激或者电转化以后长的单克隆摇菌后用我的特异引物扩增却不能扩出我要的片段，那么就是载体自连，但是载体是用双酶切切的怎么可能自连呢？一直不明白！
我的酶切体系严格按照NEB说明书，用的都是NEB的酶，酶切质粒到是可以检测酶切完全了。但是我的目标片段酶切却很难检测是否酶切完全！
我是对我的目标片段两端加保护碱基+酶切位点了的！
连接过程：
载体2ul+目标片段6ul[保证二者摩尔比为1：3]在45度加热5分钟后置于冰上
加晶美10XT4Ligase Buffer 1ul
           T4Ligase 1U
           5mMATP 1ul
           16或22度1-4hours
转化大肠杆菌感受态【热激电转都做过】要么长的满皿都是斑要么很少斑，一挑检测全是假的，没有目标片段，抽过质粒检测酶切后本该一条带，但是结果是三条带而且没有和我的目标片段一样大小的带！怎么办啊？好郁闷啊！
不知道是哪步出现问题啦？我想请教哪位大虾能把您的转基因载体构建的全过程详细地告知我？真是日夜期待啊！我的邮箱是wanlili122@yahoo.com.cn
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好好学习，努力工作
1楼 2008-04-21 22:35:14
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):有详细介绍就好了,我看了下,不敢确定是搂住所需.
是不是该去一下磷酸化？？？？？？
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____/\~~~/\,----(..)/\____//|(\|(^\/___\/\||__||__|-"
2楼2008-04-21 23:44:59
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sevenlight967

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
目标片段很难检测是因为PCR产物吧。
如果这样，不妨先把该PCR产物克隆到TOPO载体中(TA连接)。
然后鉴定一下是不是能酶切。

二楼说的载体去磷酸化也能大大减少自连。
你自连这么多，是不是没切完全啊。
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3楼2008-04-22 01:08:05
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十比

木虫 (著名写手)
很有可能是目标片段的酶切问题，有的酶就是很难切，片段的酶切应该过夜且久一点吧，要么就先克隆到T载体上，然后再从载体上切就很容易且可电泳检测；
回收后的片段最好与Marker一同电泳来估测浓度，然后计算加入量。连接我一般16度3-4小时。
载体如果双酶切充分，应该自连的机会很小的。
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4楼2008-04-22 09:50:38
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碧荷叶

铜虫 (初入文坛)
载体双酶切自连会不会是两个经双酶切的载体连在了一起？
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5楼2008-04-22 09:59:10
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korc

铜虫 (小有名气)
NEB有些酶双酶切会有问题，要不试试看单独切，或者换特殊的buffer
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6楼2008-04-22 10:28:01
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jingleyj

新虫 (初入文坛)
双酶切一般不会自连，除非两个酶是同尾酶，如BamHI和BglII.你先看看它们会不会是的载体自连。然后你可以同浓度的载体转化一个，作为负对照，看你处理的载体有没有问题。双酶切是不用去磷酸化的。
你可以用载体上的引物PCR，如果批条带来，拿PCR产物测序，看看连进去的到底是什么东西。
你提质粒有三条带可能是线性质粒，环状质粒，超螺旋质粒。
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7楼2008-04-22 18:58:55
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wanlili122

木虫 (正式写手)
我将载体去磷酸化了的，但是转化后长的斑只有4-5个样子，摇菌检测后发现还是空的。我现在准备用单酶切来做，只有换载体才行啦！我的载体是attB系列的上面有致死的ccdB位点，本来是可以做BP反应的，我用这个载体做酶连的。我用的酶是SacI和AscI酶切，SacI和KpnI酶切过。
由于我是将基因全长导入到载体中，为保证全长2900和3300bp【两个基因】能全部导入，我直接在序列端加上了保护碱基5-6个+酶切位点，引物为27-28bp，在全基因组中扩增的。不知道大家做全基因组载体构建是否也是这样做的？谢谢
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好好学习，努力工作
8楼2008-04-22 19:58:53
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zhoulina_0901

你好！
       我曾经做过分子克隆方面的实验，进行到目的片段与表达载体连接时也遇到过类似的情况，时间长达一个月之久。请教过很多老师和同学，都没得到正确的解决方法。于是尝试各种方法，重复做酶切-连接-电转-涂板-酶切及PCR验证，实验结果千奇百怪，不过我只能确定一点，就是没连上，但问题出在哪，我也不清楚。后来想了一个很笨的方法，就是从不同的阶段开始做重复试验，最后终于连接上。总结一下我的经验：1.目的基因片段太大，酶切不彻底。建议目的基因片段和表达载体的酶切体系应该适当扩大，比如酶切体系均为100μl，37度过夜后回收纯化，电泳检测看看回收效果再连接。2.可以将目的基因先克隆到T载体上，然后再从载体上切就很容易且可电泳检测；这样保证你的目的片段正确性。3.目的基因   4ul
          solution I 5 U
          表达载体  1ul
16度12-16小时。
载体如果双酶切充分，应该自连的机会很小的。
4.感受态和电转时需要注意一些
我就知道这些，不知道对你是否有用，祝你早日解决问题，实验顺利
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9楼2008-04-22 20:04:16
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wanlili122

木虫 (正式写手)
先谢谢楼上提出的建议，我现在结合大家的建议做一下！
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好好学习，努力工作
10楼2008-04-23 08:27:04
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