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sunhainan666

银虫 (小有名气)

[求助] 请问各位大神们，克隆基因仅仅拿到了ORF还需要继续克隆5’和3’UTR吗？ 已有2人参与

进行基因功的研究，可能会构建超表达载体转拟南芥和其他植物。
后期还可能做到转录因子和这个基因启动子的互作情况！
请问各位因为直接从转录组中拿到的序列，拿到转录组序列后找到ORF后blastX发现是全场ORF，是不是直接可以高保真酶拿全长ORF呢？还是要一步一步中间片段，3’ 5’慢慢做呢？如果直接高保真拿到了ORF全长，就我以后要做的这些实验，有没有必要继续克隆5‘和3’ UTR？
小弟初入分子生物学，还请大神们多多指教！不胜感激~
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1楼 2014-09-13 00:22:00
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bioplant

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunhainan666(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-14 09:26:53
只要能设计引物扩增出该ORF，则功能研究不需5‘3‘扩；若需启动子则通常需做5‘-RACE，除非ORF也能设计幸运的引物。3‘可不做，除非该类基因3‘有增强子等调控序列。

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2楼2014-09-13 07:56:52
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sunhainan666(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-14 09:27:02
应该说分析是不用的，但克隆的时候一般不能直接是ORF的，直接ORF扩增不大好扩，也容易出现错误，一般没那么好运气，我们就在5‘和3’设计合适引物。
至于后面要做什么启动子什么的后面再弄，那个比基因克隆麻烦的多
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3楼2014-09-13 10:35:42
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sunhainan666

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bioplant at 2014-09-13 07:56:52
只要能设计引物扩增出该ORF，则功能研究不需5‘3‘扩；若需启动子则通常需做5‘-RACE，除非ORF也能设计幸运的引物。3‘可不做，除非该类基因3‘有增强子等调控序列。

也就是说只要我拿到的序列中包含全长ORF就可以了，5’不需要一直往前克隆到帽子结构，3’一直往后到poly A尾巴？
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最美的不是下雨天，是曾和你一起躲雨的屋檐
4楼2014-09-13 12:14:55
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bioplant

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sunhainan666: 金币+7, ★★★★★最佳答案, 多谢 2014-09-18 14:44:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunhainan666 at 2014-09-13 12:14:55
也就是说只要我拿到的序列中包含全长ORF就可以了，5’不需要一直往前克隆到帽子结构，3’一直往后到poly A尾巴？...

关键是后续研究能否在己得到的序列上设计合适的引物，能则幸运，不能RACE，不能则需RACE。

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5楼2014-09-15 06:39:12
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