至尊木虫 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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RXMCDM: 金币+1, 多谢应助！ 2014-08-24 08:44:53
wo的海宝圆圆: 金币+10, 翻译EPI+1, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2014-08-24 10:24:23
从一升对数生长期后期之培养细胞收集细胞（细胞密度为每升0.4至0.5克干重），用150ml 100 mM的磷酸钾缓冲液（pH 7.0）洗涤，最后悬浮于10ml该缓冲液。
将该浓缩细胞悬液用含有10 mM MgSO4和150 mg卵溶菌酶（默克公司,达姆施塔特, 德国）的200 ml 100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）稀释。细胞悬浮液在30°C孵育30分钟，加入饱和K2SO4至终浓度为0.15 M，以裂解细胞。随即用含有每毫升50微克（终浓度）RNA酶（Miles实验室，斯劳，英国）和每毫升50微克（终浓度）DNA酶（Miles实验室，斯劳，英国）的70ml 100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）. 溶液于 30°C孵育20分钟后，加入K-EDTA（pH 7.0）至终浓度为15 mM，并继续孵育10分钟。加入MgSO4（终浓度为20 mM）后，混合液离心（30分钟，48，200 x g， 4°C：第一次高速离心）。含有细胞膜、细胞、细胞碎片的沉淀悬浮于25 ml含有10 mM MgSO4的 50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）。通过离心（70分钟，750 x g，4°C）去除（为破碎的）全细胞以及细胞碎片。小心倒出（并收集）含有细胞膜囊泡的上清。（上清再次）离心（30 分钟, 48,200 x g, 4°C：第二次高速离心）。将亮黄色沉淀悬浮于含有10 mM MgSO4的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中，至终浓度为每毫升35 mg膜蛋白。分装成0.1 ml到小份，快速冷冻并保存在液氮中直至使用。 |
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