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lybio

金虫 (正式写手)

[交流] 急!单酶切为何出现多条带?

用EcorIII进行单酶切重组质粒(确定只有一个此酶切位点,而且质粒用其他酶切,得到对的相应条带),反应体系10ul:酶0.5ul,质粒3ul,buffer 1ul,灭菌DD水 5.5ul ,37度过夜酶切,结果电泳出现4个条带,其中有一条只有400bp,而且条带很宽,不解是什么原因?希望得到大家的帮助,谢谢!
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pph0259

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
质粒不纯的可能性较大;
2楼2008-04-13 22:20:13
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lybio

金虫 (正式写手)

用试剂盒提的 ,应该纯度可以保证,而且用双酶切条带正确
3楼2008-04-14 17:56:36
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lingyu20071001

银虫 (小有名气)

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
可能没有完全切开,建议加1ul酶试试
4楼2008-04-14 19:07:02
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xxh8372

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫微笑研究僧

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
这个应该是外源片断含有这个酶的酶切位点

当然具体也不是很好分析,强烈建议上一个图

另外还没有介绍外缘片断的大小,等等
____/\~~~/\,----(..)/\____//|(\|(^\/___\/\||__||__|-"
5楼2008-04-14 20:14:27
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十比

木虫 (著名写手)

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
没有完全切开,建议减少质粒的量,应该一微升就行啦。
6楼2008-04-14 23:14:30
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lybio

金虫 (正式写手)

EcorIII酶切位点是我特意通过重叠延伸PCR得到的酶切位点,可保证基因中没有这个酶切位点,且连接的是T simple 载体,没有其他酶切位点。昨天又做了此酶切,酶量加大到0.8ul,质粒3ul,还是出现多条带,纳闷。决定先去测个序看看
7楼2008-04-15 13:54:18
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lybio

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 十比 at 2008-4-14 23:14:
没有完全切开,建议减少质粒的量,应该一微升就行啦。

1ul 会不会太少了,根本见不着条带
8楼2008-04-15 13:56:12
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lybio

金虫 (正式写手)

是质粒太浓了,用量少点的话,就没问题了
9楼2008-05-20 12:21:11
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