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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教：转化平板不长菌落
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逸风

金虫 (小有名气)

[交流] 请教：转化平板不长菌落

连接所用目的基因和载体片段都已酶切好，胶回收。
通过marker比对，计算两者连接计量
按照Takara T4连接酶25ul体系加反应成分
但板上只有气泡，没有菌落
请教是什么原因？？？？
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1楼 2008-04-13 09:20:49
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wwfifa

铜虫 (小有名气)
目的基因与载体片段是否已连接，把问题写详尽点吧
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2楼2008-04-13 10:02:56
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yellow.

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
一点一点排查吧，
有没有做空质粒转化对照，检测一下感受态是否有问题
排除感受态的问题后，就可能是你连接不成功了
用错抗生素或者量加的太多，这个状况应该不会出现吧
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3楼2008-04-13 10:54:40
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long0553299

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
你用的是什么突宿主菌?
通常做表达时,先将连接产物转化至DH5a,这样可提高转化率.
我认为你的感受态可以不好使,转个空载体进去看看
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4楼2008-04-13 11:52:45
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wuhuifang909

金虫 (初入文坛)
我现在也遇到同样的问题，就是不长菌落！和楼主交流下，你做感受态时加卡那霉素了吗？我加了之后没长起来，不知道什么原因。
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5楼2008-04-13 16:52:09
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mklpumc

木虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
连接时用１０ul体系，１６度２４小时后，全部加入到感受态细菌中转化，应该就能做出来的！
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6楼2008-04-13 20:53:41
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
步骤不够详细，通常做感受态都不加抗生素。还是按照严格的是严要求把该做的对照都做齐了然后再确定什么原因吧。
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金币是赌出来的
7楼2008-04-14 08:35:28
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yellow.

引用回帖:
Originally posted by wuhuifang909 at 2008-4-13 16:52:
我现在也遇到同样的问题，就是不长菌落！和楼主交流下，你做感受态时加卡那霉素了吗？我加了之后没长起来，不知道什么原因。

做感受态的菌株没有任何抗性的，成功转入质粒后，质粒上的抗性基因赋予菌体相应的抗性，这是利用抗性筛选阳性转化子的一个原理。
做感受态细胞时就加抗生素，没长起来还好，要是能长起来，那你就麻烦了！
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8楼2008-04-14 09:35:57
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