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C18柱之前的样品酸化产生沉淀 已有1人参与
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| 蛋白质在蛋白酶消化后，要对其进行酸化，然后上C18柱纯化；但是我不论用0.1%TFA还是FA酸化样品都产生沉淀，造成了很多的样品损失；我用的是FASP方法，Microcon YM-30 (Millipore, Cat. No. 42410)，也就是说没被消化的蛋白和trypsin会被膜滤掉的。请不吝赐教，多谢！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
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新的解答：入6M盐酸胍或者8M尿素的方法进行溶解，配置TFA/盐酸胍缓冲溶液的方法是：以配制1升为例，称取高纯度的盐酸胍579.2g（6mol），用0.1%（体积分数）三氟乙酸缓冲溶液加 1.C18柱是反相层析柱，即柱的介质是疏水的18碳烷基共价结合在硅胶柱上，所以要挂上柱应该是使用极性的流动相，挂上了柱再用非极性的流动相把蛋白质样品从疏水的疏水的18碳烷基基团上挤下来获得样品。 2. 用0.1%TFA还是FA酸化样品都产生沉淀，造成了很多的样品损失的问题，可以用增加蛋白质样品的溶解度的方法。具体可以用加以溶解，并且定容至1L，混合后，经过0.45μm水系微孔滤膜过滤，超声波脱气10min。 |
3楼2014-12-29 09:49:04
凌波丽
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【答案】应助回帖
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我提点个人的建议： 1.C18柱是反相层析柱，即柱的介质是疏水的18碳烷基共价结合在硅胶柱上，所以要挂上柱应该是使用极性的流动相，挂上了柱再用非极性的流动相把蛋白质样品从疏水的疏水的18碳烷基基团上挤下来获得样品。 2.TCA和FA酸化后形成的蛋白质沉淀不一定就损失了。可以过滤收集已有的沉淀，可以加入蒸馏水并且低温下用超滤离心管超滤去掉酸后，必要的话可加入少量的弱碱加以调节值pH。之后还有沉淀未溶解用表面活性剂重新溶解然后上样，考虑到生物大分子的可能大幅度的变性（小幅度的变性可能对于C18柱上柱还有帮助，因为可以使蛋白质更多的暴露的疏水面）可能，一般不推荐单纯使用酸性和碱性强的流动相，因为变性虽然使蛋白质更多的暴露的疏水面，但是可能影响蛋白质的稳定性和造成蛋白质的聚合。 3.既要酸化蛋白质（至少可以使其暴露出一些疏水表面），又要避免蛋白质分子发生聚合怎么办？可以用加入样品的上样液中一些去垢剂或表面活性剂；如果有必要的话，在流动相也可以加入少量的去垢剂或表面活性剂（后者一般不用，除非流动相进柱出现柱子被堵的情况，或者该种设备的流动相配方里的确有少量的去垢剂或表面活性剂）。 加入去垢剂或表面活性剂进入样品的上样液的理由如下： 去垢剂或表面活性剂是具有亲水基又具有疏水基的物质，能够在低于临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）时有效结合于蛋白质的疏水区域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。 一般考虑对于生物大分子的层析，适宜使用中性去垢剂或生物表面活性剂。 中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如 PEG200；多元醇类表面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如 Igepal CO、乳化剂 OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。 也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、 琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。 这样蛋白质样品暴露出疏水面在流动相中被去垢剂或表面活性剂占领，通过疏水的18碳烷基时，去垢剂或表面活性剂会有相当多的比例的分子因为竞争而被18碳烷基挤走，做个比喻：大强盗（18碳烷基）赶走了小强盗（去垢剂或表面活性剂）占领了地皮（蛋白质的疏水表面），如此暴露出疏水表面的蛋白质就挂在疏水的18碳烷基的基团上。 另外上C18柱时，流动相的极性和离子强度应该比较强才容易上柱。洗脱时正好相反，而且可能再次用到表面活性剂或咪唑之类的疏水性试剂。 洗脱时请同时考虑硅胶介质的酸碱耐受范围。 |
2楼2014-08-24 17:21:49
凌波丽
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4楼2014-12-29 09:50:53