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酷恋花

木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白在云母表面的吸附力强吗？已有1人参与

想用原子力对云母上的蛋白成像，可是涉及到除盐的问题，不知道云母对蛋白吸附能力如何，用清水清洗会不会把蛋白液洗掉了···已经卡了好久了，先给大神跪拜一个···
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莫懈怠，时间不多了！
1楼2014-08-14 11:13:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
硅烷化单分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白质固定化中的应用

凌波丽

2014年8月23日

硅烷化单分子膜应用在玻璃片等二氧化硅基片的表面的蛋白质固定化已经是比较的生物固定化技术。玻璃片、石墨和云母是扫描电子显微镜观察蛋白质的常用的载体。石墨和云母到含有大量的二氧化硅成分，且二氧化硅成分石墨和云母与其他成分呈现比较均衡的混合式分布，即在石墨和云母的表面的组成的比例中有足够比例的二氧化硅。与此同时，二氧化硅也是硅玻璃的主要成分，因此把蛋白质样品固定在玻璃片表面的硅烷化单分子膜的实验方法也能够适用于在石墨和云母片状材料上的固定化。如果要在玻璃片等二氧化硅基片的表面覆盖上硅烷化单分子膜的前提是：玻璃片等二氧化硅基片的表面不需要有含有游离的羟基的活性的硅醇存在，如图1所示，而且也不是所有的硅醇都能够发生硅烷化反应。
图1.“Types of hydroxyl group on silica surfaces. These are four possible types of SiOH groups on silica surfaces in which only the geminal and isolated silanols（硅醇） are reactive. Siloane(硅氧烷)和Vicinal silanol（硅醇）是没有反应活性的。”（图1及其说明文字引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,3）这也就是说要在玻璃表面形成有反应活性的geminal silanol and isolated silanol这两种硅醇，而Siloane(硅氧烷)和Vicinal silanol是没有反应活性的，

本文参考资料与下载处：
1.A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999, 1-78,171-186.
全书下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=578928

2.J.M.Guisan edits, Immobilization of Enzyme and Cell,Humana Press,2006,185-203.
全书下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7808926

3.P.C.Braga and D.Ricci, Atomic Force Microscopy, Huamana Press,2003, 1-49, 217-254, 291-313.
全书下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7808991

文中大量引用各位专家学者的图像和文字资料，仅仅用于科研交流的非营利性目的，并且全部给出了出处，同时对各位专家学者深表感谢！

一、        玻璃片等二氧化硅基片的表面的羟基化形成活性硅醇
有些玻璃的表面本来就有羟基存在，但是不是说这些羟基就必定会大量存在和稳定存在。而不幸的是现在不少的生物份固定化和生物芯片的实验手册的实验出发点都是玻璃的表面本来就有羟基存在，当然这也是因为很多的实验室是直接购买表面本来就有羟基存在的实验用的载玻片或二氧化硅基片。但是如果没有这个条件，我们就必须用普通玻璃自行制备玻璃表面的羟基了。
玻璃片表面的羟基化的实验步骤（举例）：
Protocol 1.玻璃片表面的羟基化
材料：
双氧水，浓硫酸，去离子水，乙醚
方法：
1.把需要的玻璃片切割成需要的形状，放入装有去离子水的烧杯，并且封口膜封口。
2.对于上面的烧杯用超声波处理30min，就是清洗玻璃片表面。
3.在第2步处理完毕之后，倒掉烧杯里的去离子水，放入新的去离子水，然后封口，再用超声波处理30min。再重复操作次清洗过程3-4次。
4.倒掉烧杯中的去离子水，倒入适量乙醇（70%浓度的乙醇即可）冲洗一下玻璃片和烧杯，然后倒掉乙醇，再加入同样浓度的乙醇溶液，再用超声波处理约10min。
5.倒掉烧杯中的乙醇，倒入适量乙醚冲洗一下玻璃片和烧杯，然后倒掉乙醚，再加入同样浓度的乙醚，再用超声波处理约10min。
6.倒掉烧杯里的乙醚，然后用氮气吹干剩下的残留乙醚。
7.将上述处理过的玻璃片放入浓硫酸和双氧水体积比3:1，在80至90度的水浴锅中浸泡1到2小时。要先加加双氧水进烧杯，后加浓硫酸烧杯，必须将浓硫酸缓缓地沿器壁注入水中，同时在注酸入水的过程中要不停地搅拌，以便散热。因为浓硫酸溶于水由于浓硫酸溶于水中，要与水结合成水合物时放出大量的热，如果后加水，会导致硫酸飞溅所以先加浓硫酸，水少起不到吸热的作用，可能会使得浓硫酸飞溅出来伤人。先加水，后加酸，酸少，所以每单位时间的发热量少，且双氧水的比热较大，又在搅拌，升温不明显。双氧水在这里与浓硫酸混合时与水的作用差不多。比较保险的办法，混合双氧水和浓硫酸时，将容器置于一个更大的容器——比如盆中，在位于盆里的装盛浓硫酸和双氧水的烧杯的周围放置大量的冰块（紧贴着烧杯壁），然后再用前面的混合操作。操作时要带上耐酸腐蚀的手套和穿上白大衣，最好再戴上帽子、口罩和护目镜。在做实验时被嘲笑“怕死”，没有什么关系，比真的发生事故要好得多。这步实验有一定危险性，请事先查阅有关“浓硫酸稀释”的实验操作方法。配制浓硫酸和双氧水体积比3:1的反应液可以与清洗玻璃片的工作平行进行。
8.弃去反应后的浓硫酸和双氧水混合液入专门的废液缸里，并加入氢氧化钠，使其成为中性。取出处理过的玻璃片，用去离子水冲洗干净，然后用氮气吹干。
9.检测玻璃片表面的羟基化效果。可以用红外傅里叶变换光谱检测玻璃片上是否有羟基的特异性吸收峰，这是最为方便的检测方法。
现在已经有表面经过活化的带有羟基或者氨基的玻璃产品出售，用作生物芯片实验室的实验材料。
石墨和云母的表面通过二氧化硅的羟基化反应基本上可以用上述的实验操作，因为其中的二氧化硅与其他成分是以混合物形式存在于石墨和云母中，后两者的表面也应该有不少二氧化硅成分，因此能够通过Protocol 1的操作，在石墨和云母的表面形成有反应活性的geminal silanol and isolated silanol两种硅醇。

二、硅烷在玻璃等二氧化硅基片的表面与硅醇的羟基反应形成带有活性基团的单分子层

在含有二氧化硅的介质表面一般会用硅烷化反应是过羟基共价连接上一层单分子膜作为结合蛋白质的连接体的最容易的和最有效的一种方法。硅烷有很多种，既然用于在石墨和云母的表面要固定蛋白质，那么用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS) 或者1,3-Trimethoxysilylpropylethylene（1,3三甲氧基丙基甲硅烷基乙烯）。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)的结构式及其与二氧化硅基片的表面的羟基的反应时见图1（引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）所示，3--巯基丙基三甲氧基硅烷与氨基丙基三甲氧基硅烷的不同点就是把3-氨基丙基三甲氧基硅烷的头上的氨基换成了巯基而已，两者的三条甲氧基腿都是一样的，而且氨基和巯基离三条腿上的甲氧基都挺远，所以两者与二氧化硅基片的表面的羟基的反应的条件都差不多。


图2（引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）
Figure 2“ (a) A diagram of an aminosilane molecule is depicted (/eft), (b) The reaction of the aminosilane's methoxy groups（氨基硅烷的甲氧基基团） is shown (right), where x can be the glass surface, hydrogen (i.e. water), or another aminosilane（氨基硅烷） molecule. The role of water in determining the extent of cross-linking with other aminosilane（氨基硅烷） molecules is apparent from this schematic.”（图2的文字说明引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）

下面给出具体的3--巯基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS)共价连接在二氧化硅基片的表面的羟基形成了单层的分子膜的反应的Protocol,引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,74.除了加上一些比较专业的术语的中文释义外，为了更加明确实验流程能够用于玻璃片，我把实验流程中的基片的叙述中的“ glass slides(载玻片)”直接放到了Reagents栏目里，并且把原来的Reagents改为了Reagents and Materials。
我把完整的实验流程贴在这里是因为现成的包括玻璃片在内的二氧化硅基片的表面的硅醇的羟基与3--巯基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS)共价连接在二氧化硅基片的表面的羟基形成了单层的分子膜的反应的Protocol,不好找，分散在各个SCI论文中，而在实验手册中难找到。

Protocol 2.“Deposition（沉淀、沉积） of silanes 'monolayers'（硅烷单分子层） on SiO2 and glasses as adhesion layers to promote the attachment of gold and platinum

Reagents and Materials
. MPTS (3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巯基丙基三甲氧基硅烷)
. iPA（异丙醇）
. glass slides(载玻片)

Method
1. Always use fresh MPTS ((3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巯基丙基三甲氧基硅烷,Sigma), as the cost of the silane（硅烷） is low relative to cost of the gold used in the evaporation. Silanes (3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巯基丙基三甲氧基硅烷) should be kept refrigerated prior to use, and allowed to come to room temperature before opening, thus avoiding condensation of atmospheric moisture（大气湿度） into the stock solution. Old solutions oligomerize and the mercapto（巯基） groups oxidize, thus making them less effective in bonding the evaporatedAu.
2. Place the substrates (which may typically be several glass slides(载玻片) )in a suitable holder (slide rack) and immerse in a wide brimmed reflux vessel containing a solution of 400 ml iPA, 10 g MPTS(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巯基丙基三甲氧基硅烷), and 10 g H2O.
3. Reflux（逆流、倒流） the solution for c. 10 min and then place the reflux vessel in a
bowl of cold water to speed cooling of the solution prior to the removal of the substrates.
4. On removal from the cooled solution, place the substrates in a beaker （烧杯）of iPA and leave for several minutes to allow the silane-containing solution to be rinsed off the substrate/holder surfaces.
5. Rinse well with iPA（异丙醇）, blow dry as above, and then bake in 105°C oven for 10 min. If the oven temperature exceeds 115°C, the thiol（巯基） will always oxidize and the gold will not adhere. Remember the coating is only a few atoms thick, and the oxidation reaction is irreversible.
6. The procedure for coating the substrate with the mercaptosilane（巯基硅烷） should
be repeated at least once, in order to ensure complete coverage.
7. Evaporate the gold or platinum A00 nm) within one day of preparing samples, otherwise the substrates will get covered in adventitious 'dirt' and an increasing proportion of the modifier's thiol（巯基） groups will oxidize. Note in the authors' laboratories it has been shown using XPS measurements that after two days 50% of the surface sulfur species
(which will interact with the evaporated metal) have been oxidized. ”XPS： X-ray photoelectron， X射线光电子能谱。
——Protocol 2引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,74.

石墨和云母富含有二氧化硅，其表面也有二氧化硅，经过Protocol1的处理，其表面也会出现有反应活性的geminal silanol and isolated silanol这两种硅醇，那么就当作比较粗糙的二氧化硅基片来共价连接硅烷的单分子层。

三、玻璃等二氧化硅基片的表面的硅烷化的单分子层的形成后，如何在单分子层上共价连接上蛋白质。

3--巯基丙基三甲氧基硅烷在二氧化硅基片表面的形成的单分子层上游离的巯基，该巯基能够需要固定的蛋白质的分子表面的巯基形成二硫键，以达到需要固定的蛋白质于二氧化硅介质表面的3--巯基丙基三甲氧基硅烷单分子层的目的，也就把固定的蛋白质固定在了二氧化硅基片。石墨和云母富含有二氧化硅，其表面也有二氧化硅，那么就当作比较粗糙的二氧化硅基片来加工上硅烷的单分子。

3--巯基丙基三甲氧基硅烷单分子层在二氧化硅介质表面的形成的反应流程也基本上适用于：3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)共价连接在二氧化硅基片的表面的羟基形成了单层的分子膜的反应。

3--巯基丙基三甲氧基硅烷上的游离的巯基具体如何共价结合蛋白质分子的实验流程请参考：J.M.Guisan edits, Immobilization of Enzyme and Cell,Humana Press,2006,193-203，内容比较多，就不再引述，请直接参考原文。

3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)因为有个游离的氨基，所以在固定化蛋白质的时候非常有价值，可以用碳二亚胺（carbodiimide）催化蛋白质分子表面的游离的羧基与3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)形成酰胺键构成蛋白质固定于有3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)单层分子膜的SiO2的基片上；也可以用戊二醛作为桥梁，把蛋白质分子表面的游离的氨基与3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)的游离氨基分别与形成戊二醛形成共价键,而达到交联的效果。具体实验流程如下：

Protocol 3.“Protein immobilization with aminopropyltriethoxysilane （3-氨基丙基三甲氧基硅烷）and glutaraldehyde（戊二醛）
Equipment and reagents
• Vacuum oven • Carbonate buffer: 0.1 M sodium carbonate
• 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) PH 9•2
(Aldrich, Sigma) • Glycine
• Absolute ethanol • 0.2 M ethanolamine
• Glutaraldehyde, E.M. grade {Sigma, Poly- • Antibody solution: 0.5 mg/ml in carbonate
Sciences) buffer
• PBS
Method
1. Immerse the solid support in 5% APTS in distilled water for 30 min at room temperature.
2. Rinse the silanized support thoroughly with distilled water and absolute ethanol sequentially.
3. The support is then cured in a vacuum oven at 80°C overnight.
4. Immerse the silanized support in a 2.5% glutaraldehyde solution in carbonate buffer for 2 h.
5. Rinse the treated support thoroughly with PBS.
6. Immerse the modified support in a 0.5-0.6 mg/ml antibody solution for 7-8 h.
7. Rinse the antibody coated support thoroughly with PBS.
8. To block the unreacted aldehyde groups, the antibody coated support is immersed in either 0.2 M ethanolamine or 0.1 M glycine for 1 h.
9. The final product is rinsed thoroughly with distilled water and stored in PBS.”
———Protocol 3引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,9-10.

Protocol 4.”Protein immobilization with aminopropyltriethoxysilane（3-氨基丙基三甲氧基硅烷） and carbodiimide（碳二亚胺）

Equipment and reagents
• Water-bath (75°C) • Phosphate buffer: 0.03 M H3PO4, pH 4
• Oven(炉，115°C) • 1-cyclohexyl-3-B-morpholinoethyl)carbodiimide (一种碳二亚胺，CMEC)
• Aminopropyltriethoxysilane (3-氨基丙基三甲氧基硅烷，APTS)
• Hydrochloric acid (HCI) • PBS

Method
1. Immerse the cleaned solid support into a 10% (v/v) APTS in distilled
water.
2. Adjust the pH of the silane solution to between pH 3-4 with 6 M HCI.
3. Place the silane（硅烷） /support mixture in a water-bath at 75°C for 2 h.
4. Rinse（冲洗、漂洗） the solid support thoroughly with distilled water.
5. Dry the silanized support in an oven at 115°C for a minimum of 4 h.
6. Place the silanized（硅烷化的） support in 0.03 M  H3PO4 buffer and add 2-4 mg/ml CMEC(一种碳二亚胺). Mix the solution thoroughly.
7. Add the protein solution （2 mg/ml) to the CDI/support solution, mix, and incubate overnight at 4°C.
8. Rinse the protein coated support and store in PBS.”
———Protocol 4引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,10-11.


以上，我只是做了很简单的举例说明了硅烷化单分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白质固定化中的应用，即使是硅烷化单分子膜在在玻璃片、石墨和云母表面的形成也含有很多，蛋白质的固定化的生物技术更是繁多。从我本人对此文的书写过程，我自己的确学到了很多的东西，至少现在对于硅烷化单分子膜有了初步的了解，原来连什么是硅烷试剂都不知道，虽然我的课题一部分涉及到蛋白质的固定化。硅烷化单分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白质固定化中的应用限于作者的水平、时间限制和本文的回答楼主的目的，不可能更多的涉猎，衷心希望对各位有兴趣的网友们起到抛砖引玉的目的，限于本人水平有限，错讹之处难免，还望予以指正。
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14楼2014-08-23 20:40:40
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
酷恋花: 金币+20, ★★★★★最佳答案, 感谢分享 2014-08-14 12:32:26
引号内的内容摘自：http://baike.sogou.com/v267613.htm
“云母属于铝硅酸盐矿物，具有连续层状硅氧四面体构造。分为三个亚类：白云母、黑云母和锂云母。白云母包括白云母及其亚种(绢云母)和较少见的钠云母；黑云母包括金云母、黑云母、铁黑云母和锰黑云母；锂云母是富含氧化锂的各种云母的细小鳞片。工业上尤其是电气工业中常用的是白云母和金云母。
白云母的化学式为KAl2〔AlSi3O10〕〔OH〕2，其中SiO2 45.2%、Al2O3 38.5%、K2O 11.8%、H2O 4.5%，此外，含少量Na、Ca、Mg、Ti、Cr、Mn、Fe和F等。
金云母的化学式为KMg3〔AlSi3O10〕〔F，OH〕2，其中K2O 7～10.3%、MgO为21.4～29.4%、Al2O3为10.8～17%、SiO2为38.7～45%、H2O为0.3～4.5%，含少量Fe、Ti、Mn、Na和F等。”
针对楼主的问题，对于云母的其他性质，我不太关心，我主要关心的是云母中哪些成分可以用于固定化蛋白质。白云母里含有SiO2 45.2%金云母里含SiO2为38.7～45%、H2O为0.3～4.5%，这是我比较有兴趣的。因为普通玻璃的成分主要是二氧化硅(SiO2，即石英，砂的主要成分)，而在玻璃上通过共价与非共价的吸附作用是可以将蛋白质固定在玻璃板上的，而且硅片上固定化蛋白质本身就是制备蛋白芯片的一种生产工艺。
所以云母对蛋白吸附能力是足够大的，而且有可以形成共价键的固定化蛋白质与硅片或者玻璃片（主要成分是SiO2，即石英，砂的主要成分)，用清水清洗不会把蛋白液洗掉了，能形成共价键怎么可能用水系的掉哪。
具体的反应机制和反应的protocols,我一时想不起来了。
你可以查一下：
Greg T. Hermanson，Bioconjugate Techniques，Elsevier Inc，2013，3rd edition
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6709686

你这个问题挺有意思，因为解决此问题的技术就是纳米生物学的一种关键技术，比如在生物芯片制备过程中必须要把各种生物大分子固定在无机物的介质上。我也去好好查查资料，再来回复你。
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2楼2014-08-14 12:01:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
此文我已经加入到了我在本月底发布在本版的“小木虫生物综合版与分子生物版冷点问题讨论——凌波丽 个人总结 第六季”的文章里，目前该文共有69231个字，A4纸98页，约含有70个问题的讨论。

我会在本月底以前回复楼主。因为过了本月底，我就飞米国了。再在小木虫论坛见到我，最快也是明年的春节前后。

楼主的问题问的挺有水平！欢迎继续讨论。
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3楼2014-08-14 12:12:16
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酷恋花

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-14 12:01:16
引号内的内容摘自：http://baike.sogou.com/v267613.htm
“云母属于铝硅酸盐矿物，具有连续层状硅氧四面体构造。分为三个亚类：白云母、黑云母和锂云母。白云母包括白云母及其亚种(绢云母)和较少见的钠云母；黑云母 ...

好专业啊～小木虫真是卧虎藏龙啊！那就是说我的蛋白滴到白云母上就能很好地吸附了呗？应该不至于直接形成共价键吧？总之，先把奖励给你……楼下如果也有好的回答我再追加悬赏～

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莫懈怠，时间不多了！
4楼2014-08-14 12:30:36
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