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songzuowei

木虫 (著名写手)

[求助] T7体外转录 已有2人参与

有没有哪位大神用过T7体外转录试剂盒？合成的RNA是否是单链？这样合成的RNA跑琼脂糖凝胶电泳能看到吗？条带应该是什么样子？请大神赐教！
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1楼 2014-08-11 13:22:41
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
做过这个酶，重组表达的

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2楼2014-08-11 14:09:57
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-11 14:09:57
做过这个酶，重组表达的

大神 那你们重组表达的这个酶有活性吗？能体外合成RNA吗？是跑电泳检测的吗？
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3楼2014-08-11 16:41:57
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-11 19:20:15
songzuowei: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-12 10:37:27
用过，这个出来的当然是ssRNA。
普通琼脂糖凝胶电泳是看不到的，如果看到的话肯定是你的DNA模板---消化不干净
要看到ssRNA，只能跑变性PAGE胶，或者使用安捷伦的Bioanalyzer 2100 + RNA Nano Chip
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4楼2014-08-11 18:18:08
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by soarrow at 2014-08-11 18:18:08
用过，这个出来的当然是ssRNA。
普通琼脂糖凝胶电泳是看不到的，如果看到的话肯定是你的DNA模板---消化不干净
要看到ssRNA，只能跑变性PAGE胶，或者使用安捷伦的Bioanalyzer 2100 + RNA Nano Chip

大神 后面那个比较贵 看来跑变性PAGE胶是比较好的选择，如果跑变性PAGE胶的话，合成的RNA需要特别处理吗？需要选用什么样的Loading buffer 呢？跑完变性胶胶用EB染可不可以？
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5楼2014-08-12 10:41:07
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★
songzuowei: 金币+1, ★有帮助 2014-08-12 12:42:42
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-14 20:04:40
跑PAGE胶是变性胶，一般多用甲酰胺作为RNA变性剂，用于打开二级结构，我们以前做的时候是银染。
具体的应该有资料和试剂盒可以查询，我那是十来年前做的了，细节记不大清楚了
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6楼2014-08-12 12:13:00
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by soarrow at 2014-08-12 12:13:00
跑PAGE胶是变性胶，一般多用甲酰胺作为RNA变性剂，用于打开二级结构，我们以前做的时候是银染。
具体的应该有资料和试剂盒可以查询，我那是十来年前做的了，细节记不大清楚了

按道理我也认为体外转录的RNA是单链的 是不能用普通琼脂糖凝胶电泳检测的 但网上还有很多资料说是可以的 体外转录后可以看到两条带 一条模板DNA 一条是转录成的RNA 所以我感到有点摸不着头脑了
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7楼2014-08-12 13:01:57
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半月琴zzu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
songzuowei: 金币+2, ★有帮助 2014-08-13 09:38:51
可以跑琼脂糖凝胶电泳，试剂盒有loading,
用那个就行

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8楼2014-08-12 18:51:48
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
引用回帖:
7楼: Originally posted by songzuowei at 2014-08-12 13:01:57
按道理我也认为体外转录的RNA是单链的 是不能用普通琼脂糖凝胶电泳检测的 但网上还有很多资料说是可以的 体外转录后可以看到两条带 一条模板DNA 一条是转录成的RNA 所以我感到有点摸不着头脑了...

因为ssRNA也能形成自身二级结构，所以琼脂糖电泳有时候也能看到
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9楼2014-08-12 21:10:23
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by soarrow at 2014-08-12 21:10:23
因为ssRNA也能形成自身二级结构，所以琼脂糖电泳有时候也能看到...

这个我也考虑过 但在跑电泳之前通常要经过70° 10min，冰上5min的处理，据说是为了破坏RNA的二级结构 不过还是很感谢您的耐心回复
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10楼2014-08-13 09:41:18
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