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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

应助: 1 (幼儿园)
金币: 622.8
散金: 97
帖子: 152
在线: 66小时
虫号: 1767711
注册: 2012-04-20
性别: MM
专业: 细胞增殖、生长与分化

[求助] PCR求指点已有35人参与

自己设计的引物扩增基因编码区序列
上游引物:  CCGGAATTC ATGGCCGCGCAGCTGCTGGAGG
下游引物：CGCGTCGA CTCAGCTGAGCACCTCTTCCTGGGGC
加了酶切位点和保护碱基
引物合成订单给出的tm值分别为65.9和67.8（Tm (50mM Na+) )

做了温度梯度56-64
反应条件：35个循环  Takara  Taq酶目的片段1600左右
               94    5min
               94       30s
               56-64 30s
               72       2min
               72       10min
PCR跑胶结果如图，求大神指点

jiaotu.jpg

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岁月静好

1楼 2014-08-04 17:03:01

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Phoebe.Lee

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引用回帖:

18楼: Originally posted by alicelchf at 2014-08-04 23:40:06
请写清楚你用的浓度

Takara taq （5 units/ul）    0.125ul
10x pcr buffer (Mg2+ free)    2.5 ul
25 mM Mg2Cl2                      1.5 ul
dNTP mixture (各2.5 mM）    2ul
DNA 51ng/ul                      2ul
引物F （10 mM)                   1ul
引物R  （10mM)                   1ul
ddH2O                               up to 25 ul