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悠悠飘杨

新虫 (小有名气)

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专业: 环境微生物学

[求助] 梯度PCR和touchdown PCR实验出现的问题

本人刚接触分子生物实验，实验中遇到一些问题想请教一下各位，我是做脱氯化氢酶基因linA（基因库编号D90355）的，全长471bp，用的PCR试剂是全式金的，marker是2K
用的引物Forward:GCGGATCCGCATGAGTGATCTAGACAGACTT
Reverse:GCCTCGAGTTATGCGCCGGACGGTGCGAAATG
pcr条件：95℃ 5min             pcr体系（20微升）：10×buffer 2微升，
94℃ 1min                                                             2.5mM dNTP 2微升，
50℃ 45s                                                                前引物和后引物均是0.4微升，
72℃ 1min                                                             taq酶0.2微升，模板1微升。
72℃ 7min  中间是30个cycle，这个引物和条件都是文献Metabolic profiles and phylogenetic diversity of microbial communities from chlorinated pesticides contaminated sites of different geographical habitats of India中找到的，可是得到的结果却是有很多引物二聚物产生，如图1，从左到右依次是marker,空白，样1和样2。
之后用这个引物做了一下梯度PCR（图2）和touchdown PCR（图3），稍微修改了一下PCR体系，
pcr体系（20微升）：10×buffer 2微升，
                                    2.5mM dNTP 2微升，
                                    前引物和后引物均是0.2微升，
                                    taq酶0.1微升，
                                    模板1.5微升。
梯度pcr条件：95℃ 5min
94℃ 1min
中间是54℃至65℃的温度梯度 45s
72℃ 1min
72℃ 7min 总共30个cycle，结果只有一个温度（60℃）下有非特异性条带产生，其余都没有条带出现。
touchdown PCR条件：95℃ 5min
94℃ 1min
65℃降至55℃ 45s
72℃ 1min
总共11个cycle，然后
94℃ 1min
55℃ 45s
72℃ 1min
总共22个cycle
最后72℃ 7min，得到的结果是什么条带都没有。
所以想问一下这是怎么回事，我该怎样改条件得到我想要的目的条带。

图1.jpg