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梯度PCR和touchdown PCR实验出现的问题
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本人刚接触分子生物实验，实验中遇到一些问题想请教一下各位，我是做脱氯化氢酶基因linA（基因库编号D90355）的，全长471bp，用的PCR试剂是全式金的，marker是2K 用的引物Forward:GCGGATCCGCATGAGTGATCTAGACAGACTT Reverse:GCCTCGAGTTATGCGCCGGACGGTGCGAAATG pcr条件：95℃ 5min pcr体系（20微升）：10×buffer 2微升， 94℃ 1min 2.5mM dNTP 2微升， 50℃ 45s 前引物和后引物均是0.4微升， 72℃ 1min taq酶0.2微升，模板1微升。 72℃ 7min 中间是30个cycle，这个引物和条件都是文献Metabolic profiles and phylogenetic diversity of microbial communities from chlorinated pesticides contaminated sites of different geographical habitats of India中找到的，可是得到的结果却是有很多引物二聚物产生，如图1，从左到右依次是marker,空白，样1和样2。 之后用这个引物做了一下梯度PCR（图2）和touchdown PCR（图3），稍微修改了一下PCR体系， pcr体系（20微升）：10×buffer 2微升， 2.5mM dNTP 2微升， 前引物和后引物均是0.2微升， taq酶0.1微升， 模板1.5微升。 梯度pcr条件：95℃ 5min 94℃ 1min 中间是54℃至65℃的温度梯度 45s 72℃ 1min 72℃ 7min 总共30个cycle，结果只有一个温度（60℃）下有非特异性条带产生，其余都没有条带出现。 touchdown PCR条件：95℃ 5min 94℃ 1min 65℃降至55℃ 45s 72℃ 1min 总共11个cycle，然后 94℃ 1min 55℃ 45s 72℃ 1min 总共22个cycle 最后72℃ 7min，得到的结果是什么条带都没有。 所以想问一下这是怎么回事，我该怎样改条件得到我想要的目的条带。  图1.jpg  图2梯度.jpg  图3touch.jpg |
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 核酸生物学实验经验 |
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